紅托竹蓀菌托多糖濃縮及醇沉工藝研究

敖珍，覃發玠，羅迎春，龍俊訓，向瑞琪，方開鑄，劉楊，譚紅,5*

(1.貴州民族大學 化學工程學院，貴陽 550025；2.貴州省工程復合材料中心，貴陽 550016；3.貴州醫科大學 公共衛生學院，貴陽 550025；4.貴州科學院，貴陽 550001；5.貴州省分析測試研究院，貴陽 550014；6.貴陽人文科技學院校團委，貴陽 550025)

多糖大多數來自于植物[1-5]，具有明顯的生物活性，營養價值豐富。其中食用菌多糖有多種生理活性及保健功能[6-8]，被廣泛應用于醫藥、食品、生物等領域。我國食用菌資源豐富，產值極高，常以簡單干品、腌制品、罐頭為主要商品形式[9-10]，近年來，以食用菌為原料的保健食品也出現在公眾視野中，如功能醋[11]、營養醬[12]等。紅托竹蓀是珍貴的大型藥食兩用的真菌[13-14]，由菌蓋、菌柄、菌托組成。生產者常常將菌托作為廢棄物丟掉，造成極大的浪費[15]，但紅托竹蓀菌托多糖具有明顯的生物活性，是一種極具開發價值的天然保健品，也可成為味道可口的功能性調味食品。若能夠將其豐富的營養價值利用起來，變廢為寶，不僅能促進人類健康，還能保護環境，促進資源利用。

目前，大多數文獻報道集中在紅托竹蓀菌托的提取工藝方面[16-18]，對紅托竹蓀菌托的濃縮及醇沉工藝的研究卻鮮見報道。因此，本試驗探討紅托竹蓀菌托多糖的濃縮及醇沉工藝，為紅托竹蓀菌托多糖的進一步精深加工及高效提取提供了依據，同時也為多糖成為營養豐富、美味可口的功能性調味食品提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

紅托竹蓀菌托：貴州金蟾大山生物科技有限公司。

1.2 試劑

95%食品級乙醇：貴陽金精化工廠；苯酚、硫酸、無水葡萄糖：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水：貴州省分析測試研究院制。

1.3 主要儀器與設備

藥材粉碎機、回流提取罐、單聯過濾器、單效濃縮器、刮板濃縮器 上海成界制藥設備有限公司；冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；723S可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；電子天平 沙鷹科學儀器有限公司；電加熱套 天津工業實驗室儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 紅托竹蓀菌托多糖的測定

參考NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》方法，采用苯酚-硫酸法測定紅托竹蓀菌托多糖的含量。配制0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液，分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于具塞試管中，分別用蒸餾水補至1.0 mL，再加入1.0 mL苯酚、5.0 mL濃硫酸，靜置10 min后，渦旋混合，于30 ℃恒溫水浴30 min后用可見分光光度計測定吸光度值。以葡萄糖含量為橫坐標(X)、吸光度值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，回歸方程為Y=11.478X+0.00168，相關系數R2=0.9993。

取1.0 mL樣品溶液按上述方法測定吸光度值，求其含量，按公式(1)計算多糖提取率。

(1)

式中：c為所測紅托竹蓀菌托多糖含量，mg/mL；V為多糖定容體積，L；N為稀釋倍數；m為原料質量，g。

1.4.2 紅托竹蓀菌托多糖濃縮液的制備

濃縮液的制備在貴州科學院中試設備上完成。將紅托竹蓀菌托進行除雜后,準確稱量3.0 kg原料于300 L回流提取罐中，采用熱水浸提[19]方法以1∶30(kg/L)加入純化水，在85 ℃下提取2 h，2次，真空管道抽濾，于儲存罐中合并濾液，在單效濃縮器中濃縮至原提取液體積的1/3，再由刮板濃縮器濃縮至單效濃縮液體積的1/3，將所得濃縮液置于4 ℃冰箱中，保存備用。

1.4.3 單因素試驗

1.4.3.1 濃縮比(原料質量∶濃縮液體積)對紅托竹蓀菌托多糖提取率的影響

稱取5份紅托竹蓀菌托粉末3.0 g于圓底燒瓶中，按1∶25(g/mL)加入蒸餾水，使用電加熱套在85 ℃條件下冷凝回流提取2 h，2次，抽濾，收集濾液，濾液進行濃縮(濃縮比(g/mL)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)，濃縮后分別加入4倍體積的95%乙醇，靜置12 h，離心，收集多糖沉淀，加入熱水溶解，定容，取1.0 mL采用苯酚-硫酸法測多糖含量，計算提取率，平行試驗3次。

1.4.3.2 紅托竹蓀菌托多糖的分步醇沉

參考耿安靜等[20]醇沉香菇多糖的方法進行紅托竹蓀菌托多糖的分步醇沉。取1.4.2所制備的多糖濃縮液153 mL，加入乙醇調節乙醇體積分數為10%，醇沉12 h，收集沉淀，上清液再加入乙醇，調節乙醇體積分數為20%，醇沉12 h，收集沉淀，上清液繼續加入乙醇，調節至30%，依此類推，直到上清液乙醇體積分數調節至90%。將各體積分數的沉淀凍干，稱量，得紅托竹蓀菌托多糖質量。

1.4.3.3 紅托竹蓀菌托多糖的其他醇沉工藝

取1.4.2中制備的多糖濃縮液39份(每份30 mL)，以多糖質量為指標，分別探究醇沉時間(0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，9，10，11，12，14，16，18，21，24，30，36 h)、乙醇濃度(55%、65%、75%、85%、95%)、加入的乙醇倍數(1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5倍)對紅托竹蓀菌托多糖沉淀的影響。探究醇沉時間時，按公式(2)分析多糖醇沉速度。

(2)

1.4.4 正交優化試驗

根據探究醇沉工藝對紅托竹蓀菌托多糖沉淀影響的單因素結果，取1.4.2中制備的濃縮液9份(每份100 mL)，選取醇沉時間、乙醇濃度、乙醇體積倍數為試驗因素，設計L9(33)正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.5 數據處理

試驗數據采用 OriginPro 9.0 繪圖，采用正交設計助手II V3.1專業版進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 濃縮比對紅托竹蓀菌托多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著濃縮比的逐漸減小，紅托竹蓀菌托多糖提取率先升高后降低，在濃縮比為1∶2(g/mL)時，多糖提取率最高。因此，濃縮比選擇1∶2(g/mL)為宜。

圖1 濃縮比對多糖提取率的影響

2.1.2 分步醇沉對紅托竹蓀菌托多糖沉淀的影響

由圖2可知，分步醇沉時，乙醇體積分數對多糖質量的影響較大，尤其是乙醇體積分數在40%時，得到的紅托竹蓀菌托多糖的質量最大，其質量占整個分步醇沉質量的36.4%。因此，在采用分步醇沉時，建議采用40%及以上的乙醇體積分數進行醇沉。

圖2 多糖的分步醇沉

2.1.3 醇沉時間對紅托竹蓀菌托多糖沉淀的影響

由圖3可知，醇沉時間對多糖質量無明顯影響。

圖3 多糖的不同時間醇沉

由圖4可知，醇沉速度隨著醇沉時間的增加逐漸降低，醇沉速度開始很大，隨著時間的延長，醇沉速度迅速下降之后逐漸減小，大約在5 h后趨于平緩。

圖4 多糖的醇沉速度

2.1.4 乙醇濃度對紅托竹蓀菌托多糖沉淀的影響

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，紅托竹蓀菌托多糖質量呈線性上升，乙醇濃度95%所醇沉的多糖質量是乙醇濃度55%的4.29倍，是乙醇濃度65%的2.43倍，是乙醇濃度75%的1.49倍，是乙醇濃度85%的1.18倍，由此可以看出，若想得到最大的多糖質量，需用高濃度乙醇進行醇沉。

圖5 多糖的不同乙醇濃度醇沉

由圖6可知，選用乙醇濃度55%時，燒杯中為濃縮液與絮狀的混合物，多糖絮狀沉淀沒有完全沉淀在燒杯底部，說明大部分多糖還保留在濃縮液中，沉淀不完全；乙醇濃度65%、75%、85%的沉淀呈絮狀物析出，但乙醇濃度65%、75%比乙醇濃度85%醇沉的沉淀析出少，當選用乙醇濃度95%時，多糖沉淀呈小顆粒狀而非絮狀，析出在燒杯底部，且上清液明顯比低濃度的乙醇更清亮，說明多糖幾乎完全作為沉淀析出。

圖6 多糖的不同乙醇濃度醇沉試驗圖

2.1.5 乙醇體積倍數對紅托竹蓀菌托多糖沉淀的影響

由圖7可知，乙醇體積倍數在4倍以下時，多糖的沉淀質量呈上升趨勢，當乙醇體積倍數較小時，所得多糖質量較小，在較大乙醇體積倍數時，多糖質量差距不明顯，說明多糖已完全析出。綜合考慮多糖析出及成本問題，選擇加入3～4倍體積乙醇比較適宜。

圖7 多糖的不同乙醇體積倍數醇沉

2.2 正交試驗結果及分析

2.2.1 正交試驗結果

由表2的極差分析結果可知，醇沉工藝對紅托竹蓀菌托多糖沉淀的影響大小順序為C>B>A，即乙醇體積倍數>乙醇濃度>醇沉時間，醇沉時間對多糖沉淀的影響最小，并且可以得出C3>C2>C1，B2>B3>B1，A3>A1>A2，因此最優組合為C3B2A3。

表2 正交試驗結果

2.2.2 方差分析

由表3的方差分析結果可知，在顯著水平P=0.05時，乙醇濃度與乙醇體積倍數對多糖的質量影響較大，達到了顯著水平，結合表2和表3的結果，醇沉時間對多糖質量的影響不明顯，本著高效、省時的原則，確定A1為A因素的最佳水平。

表3 方差分析結果

綜上分析，醇沉紅托竹蓀菌托多糖的最佳醇沉工藝條件組合為A1B2C3，即醇沉時間2 h,乙醇濃度85%,加入乙醇體積倍數為4倍。

2.2.3 驗證試驗

由于正交試驗優化的最佳醇沉條件A1B2C3不在正交設計表中，為檢驗最佳醇沉條件的可靠性，需進行驗證試驗，平行3次取其平均值，紅托竹蓀菌托多糖質量為3.12 g，顯著高于其他醇沉條件下的紅托竹蓀菌托多糖質量。

3 結論

本試驗對紅托竹蓀菌托多糖的醇沉工藝進行了研究，為紅托竹蓀菌托多糖的提取提供了理論依據，單因素試驗中，濃縮比為1∶2(g/mL)時所得多糖質量最大，正交試驗中，得出最佳醇沉條件為：醇沉時間2 h，乙醇濃度85%，加入乙醇體積倍數為4倍。通過本工藝研究，多糖得率能明顯提高，為紅托竹蓀菌托多糖的開發利用提供了工藝參考，促進了紅托竹蓀菌托的廢物利用，獲得更多有用的資源。