固相萃取法在蠔油風味物質定量檢測中的應用

王泰，TIN Hoe Seng

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510641；2.華南師范大學 化學與環境學院，廣州 510631)

蠔油作為福建、廣東兩省的傳統調味品，現在也深受我國其他地區消費者的喜愛。然而，不同生產廠家的蠔油產品，因原料、生產工藝的差異，其揮發性醛類、醇類、酮類、羧酸類、雜原子化合物等香氣成分的含量會發生大幅變化，對蠔油成品的風味造成極大的影響。因此，蠔油風味物質的精確定量檢測方法，對蠔油風味質量的定向提升具有重要意義。

傳統的樣品處理技術經歷了液固萃取、液液萃取、固相萃取幾個階段。固相萃取技術適用于大部分食品樣品基質的揮發性和半揮發性化合物的萃取[1]，具有消耗溶劑少、重復性好、處理效率高以及樣品通量大等特性，方便與高選擇性、高靈敏度的檢測系統聯用[2-3]，因而適用于蠔油風味物質的精確定量檢測。隨著高靈敏度、高選擇性的色譜-單質譜聯用儀以及串聯質譜儀的快速發展，2003年，美、德兩國的科學家共同研發了一種用于蔬菜、水果中痕量農藥殘留分析的QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)方法，將水溶液中的固體樣品加鹽后經乙腈萃取，再通過基質分散固相萃取(dispersive-SPE)去除乙腈中存在的大部分干擾物，最后進行檢測分析。目前，QuEChERS方法得到了長足的發展，成為檢測水果、蔬菜中農藥殘留的標準樣品處理方法。由于蠔油中添加了羥丙基二淀粉磷酸酯、黃原膠、焦糖色等添加劑，基質體系較為復雜，嚴重干擾特征風味化合物的檢測，而由于QuEChERS方法的高靈敏度與高選擇性，以及對干擾物良好的去除能力，十分適合用于特征風味化合物的精確定量檢測實驗中。

Nguyen等[4]對產自中國、泰國和越南的蠔油風味物質的相關研究顯示，檢出的風味物質主要以醛類、醇類、呋喃類、酯類、含硫化合物、吡嗪類、酮類、芳烴類、羧酸類等化合物為主，類似的化合物在生、熟牡蠣[5]以及牡蠣酶解液[6-7]中也有檢出。參照文獻中檢出的風味物質，選擇3-呋喃甲醇、5-甲基-2-乙酰基呋喃、3-(甲硫基)丙醛和2-甲基-2-丁烯醛作為本文的研究物質。這幾種風味物質中，呋喃類物質的香味特征性強，多存在于烘烤制品中，與堅果、烤肉、焦糖等香氣類似。而醛類物質的氣味閾值一般較低，蠔油中的醛類物質可能是亞油酸酯和亞麻酸酯的氫過氧化物降解的產物，提供具有清香、果香和堅果香的芳香特質的氣味，其具體風味特征見表1。

表1 蠔油中的風味化合物

本研究通過使用固相萃取方法凈化蠔油基質，考察和比較不同凈化方法對上述幾種風味物質回收率的影響，并形成完整的凈化、檢測蠔油中風味物質的方法，可以在針對大量蠔油樣品的風味物質檢測工作中加以應用。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

通過線上電商渠道，購買了6家不同生產廠商出品的6種蠔油，隱去具體生產廠商，僅以編號代稱，樣品信息見表2。

表2 蠔油樣品信息

1.2 試劑耗材

色譜純甲醇、乙腈、乙酸乙酯等：均購自美國ThermoFisher Scientific公司。

CNW Band HC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)、CNW Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱(500 mg/6 mL)：上海安譜實驗科技股份有限公司；QuEChERS萃取試劑盒(產品編號：5982-5650)、QuEChERS通用分散試劑盒(產品編號：5982-0029)：美國Agilent公司。

標準物質：均購自上海源葉生物科技有限公司。分別用電子天平稱取一定量純品，以甲醇溶解，定容到25 mL容量瓶中。

混合標準溶液的配制：按照標準物質溶液的濃度，用移液槍分別移取一定量的標準物質溶液，混合后用甲醇定容至10 mL，配制成濃度均為100 mg/L的混合標準溶液。

系列標準工作溶液的配制：用甲醇稀釋混合標準溶液，配制成濃度分別為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L的系列標準工作溶液。

1.3 主要儀器與設備

7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；HSE-12B固相萃取裝置 天津市恒奧科技發展有限公司；SQP Quintix 125D-1CN電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Eppendorf 5804R低溫高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司。

1.4 方法

1.4.1 SPE小柱萃取

蠔油樣品的提取：稱取2.0 g樣品于離心管內，加入20 mL高純水，渦旋混合均勻，用70 ℃水浴加熱10 min，待冷卻后，超聲提取20 min。離心管在4 ℃、10000 r/min轉速下離心15 min，取上清液移入新離心管中待用。

固相萃取柱的活化、上樣和洗脫：先用6 mL甲醇活化，再用6 mL水淋洗平衡；吸取10 mL上清液過固相萃取柱上樣，以3 mL/min的流速通過填料層。活化和上樣過程中應始終保持填料層的濕潤。待上樣過程完成后，再用10 mL高純水淋洗填料層，抽干萃取柱內的液體，棄去淋洗液，最后用10 mL乙酸乙酯進行洗脫，收集全部洗脫液。

洗脫液用微弱氮氣流吹至近干，用移液槍加入1000 μL乙酸乙酯，重新復溶，過0.22 μm的尼龍濾膜后，進GC/MS，采用SIM模式分析。

1.4.2 QuEChERS法

參考食品安全國家標準GB 23200.113—2018[8]的凈化步驟內容進行微調：稱取5 g蠔油樣品(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中。加入10 mL乙腈，同時加入Agilent 5982-5650中的鹽包1包及陶瓷均質子1顆，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min。振蕩后，以4200 r/min的轉速離心5 min。吸取6 mL上清液加到Agilent 5982-0029中的15 mL塑料離心管中(已經預先加入了硫酸鎂、PSA、C18等)，再加入1顆陶瓷均質子，搖勻后渦旋混勻1 min。以4200 r/min的轉速離心5 min，吸取1 mL上清液，過0.22 μm有機濾膜，用于GC-MS的測定。

1.4.3 GC/MS條件

色譜柱：DB-WAX熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

氣相條件：初始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率加熱到200 ℃，再以10 ℃/min的速率加熱到230 ℃，保持3 min，最后以10 ℃/min的速率升至250 ℃并保持3 min。載氣He，流速1.2 mL/min，不分流進樣。

質譜條件: 離子源溫度設置為230 ℃，傳輸線溫度設置為250 ℃，四極桿溫度設置為150 ℃，EI離子源，電子能量為70 eV，溶劑延遲設置為4 min。SIM掃描參數見表3。

表3 風味化合物的選擇離子掃描參數

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線

4種風味化合物的系列標準混合工作溶液濃度范圍為0.2～10.0 mg/L，使用GC/MS的選擇離子監測模式采集數據，以各化合物系列標準工作溶液的濃度為自變量，以各化合物峰的響應值為因變量，進行回歸分析，所得的標準工作曲線見表4。

表4 風味化合物的標準工作曲線

回歸曲線的結果表明，對于4種風味化合物而言，使用SIM法掃描采集數據，獲取的標準曲線相關系數r大于0.999，線性范圍接近兩個數量級，可以滿足后續分析檢測的要求。

2.2 SPE小柱萃取實驗

對C18和HLB兩種填料的SPE小柱進行凈化實驗，分別檢測蠔油1的空白樣及加標樣。空白樣按照1.4.1所述進行處理，加標樣在稱量樣品之后，分別加入4種風味化合物的標準溶液各1 μL，再依照1.4.1所述進行處理。空白樣和加標樣重復3個平行樣，實驗結果見表5。

表5 C18柱空白與加標實驗結果比對

HLB固相萃取柱的空白與加標實驗結果比對見表6。

表6 HLB柱空白與加標實驗結果比對

從C18和HLB兩種SPE小柱凈化蠔油空白樣與加標樣的實驗結果來看，加標回收率均值的結果低于理論回收率，且RSD值較大。回收率均值低的原因應是前處理過程復雜，且在不同容器之間轉移的次數較多；RSD值大意味著實驗結果的波動，樣品的平行性差，難以將SPE小柱應用于蠔油樣品的凈化過程。

2.3 QuEChERS萃取實驗

對QuEChERS方法的凈化實驗，仍采用分別檢測蠔油空白樣及加標樣的方法。空白樣及加標樣的制備方法同2.2所述，實驗結果見表7。

表7 QuEChERS前處理空白與加標實驗結果比對

由表7可知，QuEChERS前處理方法用于蠔油樣品的凈化，其穩定性較SPE小柱法好，平行樣結果的RSD<15%，說明該凈化方法的波動性小。加標回收率實驗的結果顯示，風味化合物在蠔油樣品中的回收率在92%～110%之間，說明該凈化方法在回收率指標方面也能夠滿足后續檢測實驗的要求。

2.4 蠔油中風味物質的檢測

應用2.3中的QuEChERS方法對6種蠔油中的風味化合物進行凈化，并上機分析，風味化合物的檢測結果見表8。

表8 6種蠔油中風味化合物的檢測

由表8可知，在6種蠔油中，各種風味化合物均有檢出，其中3-呋喃甲醇的含量在28.2～64.4 ng/g之間，有約2.3倍的差距；5-甲基-2-乙酰基呋喃的含量在18.2～55.7 ng/g之間，有約3.1倍的差距；3-(甲硫基)丙醛的含量在18.7～40.9 ng/g之間，有約2.2倍的差距；2-甲基-2-丁烯醛的含量在27.4～86.9 ng/g之間，有約3.2倍的差距。不同生產廠家的各蠔油中風味化合物的含量、所占比例有較大差別，推測可能是所用原料產地、生產工藝的不同所致。

3 結論

本研究通過比較SPE小柱法與QuEChERS法在凈化蠔油基質、檢測風味物質的前處理過程中的差別，確定了QuEChERS法是更適合蠔油風味物質檢測的前處理方法，結合GC/MS選擇離子檢測模式采樣，檢測方法的整體回收率在92%～110%之間，能夠滿足大量、快速檢測的需要。利用該前處理方法，對6種不同生產廠家的市售蠔油樣品中的風味化合物進行了檢測，結果顯示：該研究選擇的各風味物質均有檢出，含量在18.2～86.9 ng/g之間，濃度差別在2～3倍左右。