自然發酵的酸菜中微生物多樣性研究

續釗，盧前明

(1.鄭州職業技術學院，鄭州 450121；2.河南工程學院 資源與安全工程學院，鄭州 451191)

發酵類食品是通過微生物作用食品而制成，在我國具有豐富的歷史文化[1-2]。在我國古代，發酵是人們保存食物的一種傳統方法[3]，隨著發酵工藝經過無數次的演變和傳承，形成了我國獨特的中國食品發酵工藝[4-5]。我國傳統的發酵食品種類多樣，包括發酵谷類食品[6]、發酵蔬菜類食品[7]、發酵豆類食品以及其他與發酵相關的肉類制品[8-9]、乳品和酒類[10]。由于發酵食品具有獨特的風味，自古以來就深受我國人民的喜愛，并隨著國際之間的交流，對很多國家也產生了不小的影響[11]。現代醫學研究結果也表明，適當食用發酵食品對身體具有保健功效。

酸菜在發酵時，主要分為3個步驟[12]：發酵的前期，以需氧型微生物發酵為主，隨著發酵過程的進行，酸菜中的氧氣逐漸被消耗為無氧的環境；發酵中期，以乳酸菌發酵為主要的發酵方式，此發酵過程中，乳酸菌產生大量的乳酸，導致發酵液中的pH值迅速下降；最后，以乳酸菌中的短乳酸桿菌發酵為主，形成泡菜中的多種風味物質，此階段是泡菜中風味物質形成的主要階段。

先前的一些研究人員主要采用分離、純化和鑒定的方法，對酸菜中的微生物進行鑒定，不僅消耗大量的時間，而且培養的過程中也極易受到環境因素的影響，不能夠正常地反映出酸菜中細菌多樣性的情況，結果的可靠性也較差。近些年，隨著分子生物技術的發展和進步，也為分析復雜的微生物群落提供了先進的技術和手段。

發酵酸菜是在低濃度食鹽的條件下，利用微生物發酵而制成的一種蔬菜食品[13]。酸菜營養豐富且具有獨特的風味，同時也具有開胃健脾等生物學功能[14]。一般用于發酵的蔬菜表面具有大量的微生物，如果發酵方法不規范[15]，可能會導致一些對人體有害的微生物混入發酵酸菜中。本研究基于此條件，利用分子生物學手段，對不同發酵階段酸菜中所含的微生物種類多樣性進行研究，旨在為酸菜的標準化和規范化生產提供一個基礎理論[16]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設備

白菜：購于當地超市；食鹽：無碘鹽深井礦鹽350 g袋裝；干酪乳酸桿菌：中國微生物研究所提供。

全自動機械攪拌不銹鋼發酵罐 無錫興順生物科技有限公司；PCR基因擴增儀 上海泰坦科技股份有限公司；電子天平 山東歐萊博儀器有限公司；pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；電泳儀、臺式離心機 濟南童鑫生物科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科生物產業有限公司；ZD-9560水平脫色搖床 常州市凱航儀器有限公司；DZKW-A電熱恒溫水浴鍋 北京京創泰寧偉業科技發展有限公司；SHPY-70F生化培養箱 深圳市澳德瑪電子科技有限公司；干燥箱 鶴壁市鑫誠信儀器儀表有限公司；超凈工作臺 蘇州安泰凈化有限公司；超低冰箱 日本三洋公司；顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司；移液槍 德國Ependoff公司。

1.2 試驗所需引物

試驗過程中所需要的引物均由上海生物科技有限責任公司合成，見表1。

表1 發酵酸菜中微生物測序所需引物

1.3 培養基制作

1.3.1 MRS培養基

牛肉膏蛋白胨8 g，酵母浸膏粉4 g，磷酸二氫鉀 2 g，檸檬酸銨3 g，乙酸鈉 3 g，葡萄糖18 g，硫酸鎂1 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 6～7，121 ℃滅菌20 min[17]。

1.3.2 YPD培養基

葡萄糖18 g，酵母粉8 g，蛋白胨18 g，瓊脂18 g，pH 6～7，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min[18]。

1.3.3 PDA培養基

土豆200 g，葡萄糖18 g，磷酸二氫鉀 2 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂18 g，pH 6～7，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min[19]。

1.4 試劑盒

Ezup柱式細菌基因組DNA試劑盒，瓊脂糖DNA回收試劑盒。

1.5 自然發酵腌菜制作流程

選取優質白菜→晾曬→食鹽→裝罐發酵→腌菜。

選取優質菜，晾曬3 d，去除變黃的菜葉，用清水清洗干凈，將清洗好的白菜放于發酵罐中并進行密封，添加1%～1.5%濃度的食鹽，控制發酵罐溫度為15～20 ℃，每間隔2 d取1次樣本，連續取30 d樣本[20]。

1.6 菌株的分析純化及計數

在發酵過程中，每間隔2 d取出發酵液體的20 mL樣品，在超凈工作臺上分別稀釋10，100，1000，10000倍，分別涂布于MRS、YPD和PDA 3種培養基上，每個稀釋濃度分別涂布3個平板，然后檢測菌落的個數。

1.7 形態學鑒定

將MRS、YPD和PDA 3種培養基上分離獲得的菌落進行劃分，對形態純化獲得的菌株進行顯微鏡形態特征的觀察(菌落的大小、形態、直徑和光澤)。

1.8 樣品中DNA的提取

按照Ezup柱式細菌基因組DNA試劑盒上所攜帶的說明書進行操作。

1.9 16S rDNA分析

分離純化后的菌株進行形態學鑒定之后，將待測菌株進一步利用16S rDNA的序列進行對比和分子水平鑒定。系統發育樹的構建流程：將獲得的序列放置于NCBI中和數據庫中的數據進行比對，比對之后，確定大致類群；從NCBI數據庫中下載該類群的所有數據，將獲得的數據與這些數據進行合并，合并之后的數據上傳至MAFFT網站，對數據進行排序；將排好順序的系列上傳至Cipres網站，利用網站建立最大簡約樹，最后進行物種親緣關系分析。

2 結果與分析

2.1 菌種分離純化

由表2可知，隨著發酵時間的增長，自然發酵的酸菜中微生物多樣性先增加后不變，其中3種不同培養基最后分離出的菌株數量也不相同。MRS培養基中分離獲得7個菌株，YPD培養基中分離獲得4個菌株和PDA培養基中分離獲得3個菌株，分離效果分別為MRS培養基>YPD培養基>PDA培養基。

表2 自然發酵酸菜中分離純化的菌株種類統計

2.2 形態學鑒定

從MRS、YPD和PDA 3種培養基上一共分離出14個菌株，分別觀察形狀、大小,是否有隆起,表面是否光滑、有光澤和顏色。

由表3可知，所有分離出來的細菌都呈現乳白色，細菌大小均小于1 mm，形狀主要為圓形和近圓形，根據形態特征鑒定大致可以分為乳酸桿菌、不動桿菌、酵母菌和大腸桿菌4大類，結果表明自然發酵的酸菜中微生物多樣性豐富。

表3 分離純化菌株菌落形態

2.3 16S rDNA 鑒定

對上述的14個菌株進行16S rDNA鑒定，利用細菌基因組的DNA抽提試劑盒進行基因組DNA的抽提，在提取的DNA中加入正、反向引物，經PCR測量，將獲得的PCR產物送至上海生物科技有限責任公司進行測序。獲得原始序列后，將原始系列在BioEdit軟件上進行檢查和拼接，將拼接后得到的系列放入NCBA數據系統進行Blast比對，大致確定微生物的類群之后，下載該類群的相關物種序列，進行物種多樣性分析。

表4 分離菌株Blast比對結果

2.4 系統發育分析

從NCBI數據庫中下載相關的數據，使用MAFFT進行數據的排齊，在BioEdit中進行手動編輯，剪出多余和不合格的序列。把整理好的數據集上傳至Cpries網站，建立最大簡約樹，見圖1。

圖1 利用最大簡約樹表示自然發酵的酸菜中微生物的多樣性

由圖1可知，自然發酵的酸菜中主要分為3大類：乳酸桿Lactobacillus菌類、芽孢桿菌Esherichia類和酵母菌Candida類。其中乳酸桿菌為自然發酵酸菜中的主要類群，占11/14，酵母菌和芽孢桿菌都占有較低的比例，二者所占的比例為2/14。

3 小結

發酵酸菜具有營養豐富、風味獨特和開胃健脾等特點。目前，酸菜的發酵主要是家庭式小規模生產，存在發酵時間長、產量不穩定等諸多因素。為了人們的健康，本研究主要利用形態學和分子生物學手段對自然發酵酸菜中的微生物多樣性進行研究，研究結果表明，自然發酵的酸菜中，乳酸桿菌的種類占有主導優勢，其次為酵母菌和芽孢桿菌。