山西老陳醋丟糟微生物群落多樣性分析

羅愛(ài)國(guó)，王家彥,2，郝建偉，郭春燕，時(shí)曉麗，楊博雯，趙紅梅*

(1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 晉中 030619；2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226019)

山西老陳醋風(fēng)味鮮美，功效豐富，是深受人們喜愛(ài)的調(diào)味品，但在釀醋過(guò)程中會(huì)不可避免地產(chǎn)生副產(chǎn)物——醋糟。醋糟是原料釀醋后得到的固態(tài)殘?jiān)a(chǎn)量巨大[1-2]。目前山西年產(chǎn)80多萬(wàn)噸醋，將產(chǎn)生56萬(wàn)噸左右的醋糟[3]。由于自身含水量大，雜質(zhì)較多，不及時(shí)處理會(huì)造成醋糟變質(zhì)，進(jìn)而污染環(huán)境[4]，因此，及時(shí)開(kāi)發(fā)利用醋糟是研究人員一直關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái)，微生物發(fā)酵醋糟制備發(fā)酵飼料、制備能源等已經(jīng)成為一種熱潮[5]，而微生物是發(fā)酵醋糟的核心。

利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)解析微生物菌群只能分離鑒別少數(shù)菌種[6-7]，而且分析序列的速度慢、規(guī)模小且精度低[8]，而應(yīng)運(yùn)而生的高通量測(cè)序技術(shù)則能快速、大量、全面地對(duì)微生物菌群序列進(jìn)行分析[9-11]，因此近年來(lái)此技術(shù)被越來(lái)越多地應(yīng)用于分析微生物的豐富度和多樣性[12]。但目前幾乎沒(méi)有利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醋糟微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的研究報(bào)道,只有些應(yīng)用于食醋方面的研究，張永杰等基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了釀醋過(guò)程中的真菌群落結(jié)構(gòu)，其中釀酒酵母和黑曲霉是發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)真菌[13]。欒春光等利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了漲壺食醋中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)微生物主要分布于厚壁菌門、廣古菌門和變形菌門，其中厚壁菌門中的乳酸菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[14]。

因此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)收集醋糟樣品、提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析等流程，解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，為建立山西老陳醋丟糟微生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用醋糟提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

山西老陳醋丟糟：由晉中市榆次區(qū)宇超醋廠提供。

1.2 試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA M5635-02)；Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒(Life Q10212)；2×Hieff?Robust PCR Master Mix(Yeasen 10105ES03)；Hieff NGSTMDNA Selection Beads(Yeasen 12601ES56)。

1.3 主要儀器

Pico-21臺(tái)式離心機(jī) ThermoFisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；Invitrogen Q32866 Qubit?3.0熒光計(jì)；ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品準(zhǔn)備與預(yù)處理

收集10 g山西老陳醋丟糟，立即粉碎后密封于無(wú)菌袋中，并編號(hào)醋糟樣品為CZ，保存于-80 ℃?zhèn)溆肹15]。

1.4.2 醋糟樣品基因組DNA提取

取粉碎混勻后的醋糟樣品0.2～0.3 g，按照OMEGA試劑盒的使用要求和說(shuō)明對(duì)醋糟微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取，用0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取DNA的完整性[16]，用Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取 DNA 的濃度[17]，DNA樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆肹18]。

表1 質(zhì)檢結(jié)果

質(zhì)檢結(jié)果表明，樣品能進(jìn)行下一步擴(kuò)增。

1.4.3 ITS1-ITS2區(qū)域PCR擴(kuò)增

第一輪擴(kuò)增：用于PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA總量可通過(guò)Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行精確定量。利用引物(ITS1F和ITS2R)對(duì)真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表2。

表2 ITS區(qū)引物序列

于無(wú)菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系，見(jiàn)表3。混勻并將反應(yīng)離心于管底。

表3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：首先94 ℃預(yù)變性3 min；接著進(jìn)入下一步流程并重復(fù)5次，包括94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s；然后在94 ℃高溫條件下變性20 s，55 ℃低溫下退火20 s，72 ℃中溫下延伸30 s，該步驟共重復(fù)20次后于72 ℃再延伸5 min，第一輪擴(kuò)增結(jié)束。

第二輪擴(kuò)增：引入Illumina橋式PCR兼容引物。于無(wú)菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系，見(jiàn)表4。

表4 PCR反應(yīng)體系

將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件:95 ℃，3 min→(高溫94 ℃，20 s→低溫55 ℃，20 s→中溫72 ℃，30 s)→72 ℃，5 min(不同溫度下反應(yīng)原理同第一步)。擴(kuò)增結(jié)束后，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增效果較好，滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的要求。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

1.4.4 16S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增

第一輪擴(kuò)增：用于PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA總量可通過(guò)Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒來(lái)精確地定量。利用引物(341F和805R)對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表5。

表5 16S區(qū)引物序列

其余反應(yīng)體系與實(shí)驗(yàn)過(guò)程同2.4.3流程。

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)其產(chǎn)物。

醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增效果較好，滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的要求。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

1.4.5 高通量測(cè)序

真菌ITS1-ITS2以及細(xì)菌16S rDNA V3-V4的測(cè)序過(guò)程委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序原始序列得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，且序列中含有起始加入的引物接頭序列以及barcode標(biāo)簽序列。

首先需要對(duì)引物接頭序列進(jìn)行去除，然后根據(jù)雙端序列之間的重復(fù)關(guān)系，將所有成對(duì)的序列拼接成一條序列，再根據(jù)barcode標(biāo)簽序列區(qū)分醋糟樣品中真菌及細(xì)菌的各序列數(shù)據(jù)，之后對(duì)各序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，如對(duì)小于150 bp的短序列，低復(fù)雜度及低質(zhì)量序列等進(jìn)行過(guò)濾[19]，最后得到各序列的有效數(shù)據(jù)，即有效序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的拼接

醋糟樣品經(jīng)分析后得到真菌、細(xì)菌的原始序列分別為64558，62542條，平均長(zhǎng)度分別為199.26，460.54 bp；經(jīng)拼接、質(zhì)控過(guò)濾后，得到的有效序列分別為64558，62382條，平均長(zhǎng)度分別為157.26，422.87 bp。真菌，細(xì)菌的序列有效率分別為100%、99.75%。

表6 醋糟樣品中有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 樣品OTU分類

97%相似水平下對(duì)醋糟樣品中真菌及細(xì)菌各序列進(jìn)行聚類分析劃分操作分類單元(OTU)[20]，其中醋糟樣品中真菌有33個(gè)OTU 序列，細(xì)菌有95個(gè)OTU序列。由此可以看出，醋糟中細(xì)菌的微生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌。

2.3 樣品OTU物種統(tǒng)計(jì)

以門、綱、目、科、屬、種的順序依次將醋糟中OTU進(jìn)行分類信息統(tǒng)計(jì)。

由表7可知，醋糟樣品中的真菌菌群分布在3個(gè)門、7個(gè)綱、10個(gè)目、16個(gè)科、20個(gè)屬、29個(gè)種中；細(xì)菌菌群分布在7個(gè)門、11個(gè)綱、22個(gè)目、39個(gè)科、56個(gè)屬中。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，醋糟中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

表7 醋糟樣品各類水平OTU物種統(tǒng)計(jì)

2.4 Rank-abundance曲線

對(duì)比圖3，由圖4 Rank-abundance曲線可知，圖4中的曲線更寬，更平緩，說(shuō)明組成醋糟的菌群中，細(xì)菌菌群的豐富程度、均勻程度均高于真菌菌群。

圖3 ITS(真菌)Rank-abundance曲線圖

圖4 16S(細(xì)菌)Rank-abundance曲線圖

2.5 α多樣性分析

研究樣品中微生物的多樣性常用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)4個(gè)多樣性指數(shù)進(jìn)行描述。其中，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)被用來(lái)描述物種的組成多樣性；ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)被用來(lái)描述物種的豐富度。覆蓋率可以反映本次實(shí)驗(yàn)的取樣能否代表樣品的真實(shí)情況。若覆蓋率>97%，則證明實(shí)驗(yàn)的取樣可以反映樣品中微生物的分布情況。

由表8和表9中的覆蓋率可知，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的序列數(shù)已足夠大，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的取樣能夠真實(shí)反映醋糟樣品中的真核以及原核微生物的分布情況。

表8 醋糟真菌群落多樣性指數(shù)

表9 醋糟細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

對(duì)比表8和表9數(shù)據(jù)可知，醋糟中真菌的Shannon 指數(shù)值、ACE指數(shù)值、Chaol值均低于細(xì)菌中相對(duì)應(yīng)的值，而Simpson指數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌中的Simpson指數(shù)值。這表明醋糟中真菌的物種多樣性和豐富度均低于細(xì)菌，即醋糟中的原核微生物多樣性高于真核。

2.6 稀釋性曲線分析

由圖5和圖6可知，隨著隨機(jī)抽取測(cè)序數(shù)目的增多，曲線逐漸走向平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)目足夠大，更多的測(cè)序不會(huì)產(chǎn)生更多的OTU，測(cè)序數(shù)量足夠合理，并且從兩條曲線在縱軸上的最大截距可知，醋糟樣品中細(xì)菌菌群的OTU數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于真菌菌群，即醋糟中細(xì)菌菌群多樣性高于真菌。

圖5 ITS(真菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

圖6 16S(細(xì)菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

2.7 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

由圖7和圖8可知，隨著測(cè)定序列數(shù)目的逐步增加，曲線走向平緩，說(shuō)明了測(cè)序的深度合理。對(duì)比真菌、細(xì)菌的Shannon指數(shù)值，可知醋糟樣品中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

圖7 ITS(真菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

圖8 16S(細(xì)菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

2.8 基于門和屬水平的真菌菌群分類

醋糟樣品中真菌共有33個(gè)OTU序列。由圖9可知，醋糟中真核微生物由子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)3個(gè)門組成。其中子囊菌門占比最大，為89.847%，其次為擔(dān)子菌門，占比10.152%，最后是毛霉菌門，占比0.001%。分析數(shù)據(jù)，以豐度>1%為閾值，共得到2個(gè)門。分別是子囊菌門(Ascomycota，89.847%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota，10.152%)。

圖9 真菌門水平分布圖

分析測(cè)得數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，以豐度>0.01%為閾值，醋糟樣品共得到4個(gè)屬；以豐度>0.5%為閾值，醋糟樣品共得到4個(gè)屬；以豐度>1%為閾值，醋糟樣品共得到4個(gè)屬。由圖10可知，醋糟樣品中的真核微生物由畢赤酵母屬(Pichia，85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon，9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus，3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida，1.02%)以及一些豐度小于1%的真菌菌屬組成。

圖10 真菌屬水平分布圖

由此可以看出，在真菌屬水平組成上，醋糟中的優(yōu)勢(shì)真菌為畢赤酵母屬，其次為毛孢子菌屬，最后是雙足囊菌屬和假絲酵母菌屬，其中畢赤酵母屬為醋糟中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌菌屬；同時(shí)醋糟中還有一些豐度小于1%的真核微生物菌屬，它們?cè)诖自阏婢械恼急刃。粚儆趦?yōu)勢(shì)真菌。

2.9 基于門和屬水平的細(xì)菌菌群分類

醋糟樣品中的細(xì)菌共有95個(gè)OTU序列。由圖11可知，醋糟樣品中的細(xì)菌菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門組成，還有一些豐度小于1%的細(xì)菌菌門。其中以豐度>0.01%為閾值，共得到5個(gè)門；以>1%為閾值，共得到3個(gè)門，分別是厚壁菌門(Firmicutes，61.64%)、變形菌門(Proteobacteria，35.96%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，2.03%)。

圖11 細(xì)菌門水平分布圖

由圖12可知，醋糟樣品中的原核微生物由乳桿菌屬、醋菌屬、小球菌屬、嗜冷桿菌屬、金黃桿菌屬，還有一些未得到分類的菌屬以及豐度小于1%的菌屬組成。分析數(shù)據(jù)結(jié)果，其中以豐度>0.01%為閾值，醋糟樣品共得到19個(gè)屬；以豐度>0.5%為閾值，共得到10個(gè)屬；以豐度>1%為閾值，共得到7個(gè)屬，分別是乳桿菌屬(Lactobacillus，47.29%)、醋菌屬(Acetobacter，27.31%)、小球菌屬(Pediococcus，7.74%)、未分類的乳桿菌屬(unclassified_Lactobacillales，6.11%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，3.2%)、未分類的腸桿菌科(unclassified_ Enterobacteriaceae，2.45%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，1.32%)。

圖12 細(xì)菌屬水平分布圖

由此可以看出，醋糟中的原核微生物中占最大優(yōu)勢(shì)的是乳桿菌屬，其次是醋菌屬，同時(shí)含有一定數(shù)量的小球菌屬以及其他菌類。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，同時(shí)也對(duì)醋糟中真核微生物以及原核微生物的多樣性及豐富度進(jìn)行了分析。從醋糟樣品中得到的真菌及細(xì)菌OTU序列分別有33個(gè)和95個(gè)。

以門為水平分析醋糟樣品中的真核及原核微生物。結(jié)果表明，醋糟中的真菌最主要分布于子囊菌門(Ascomycota，89.847%)，其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota，10.152%)；細(xì)菌主要分布于厚壁菌門(Firmicutes，61.64%)，其次為變形菌門(Proteobacteria，35.96%)，最后為擬桿菌門(Bacteroidetes，2.03%)。

以屬為水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌有畢赤酵母屬(Pichia，85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon，9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus，3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida，1.02%)；樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有乳桿菌屬(Lactobacillus，47.29%)、醋菌屬(Acetobacter，27.31%)、小球菌屬(Pediococcus，7.74%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，3.2%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，1.32%)以及一些未得到分類學(xué)注釋的菌群。

該研究解析了山西老陳醋丟糟微生物菌群結(jié)構(gòu)，為將醋糟轉(zhuǎn)化為利用率更高的發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)，在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用醋糟資源，提供清潔、環(huán)保、無(wú)污染的環(huán)境中具有重要意義。