傳統豆醬自然發酵的過程中微生物多樣性及理化性質分析

李傳鳳，楊安琦，王明成

(黃淮學院 生物與食品工程學院，河南 駐馬店 463000)

豆醬的主要原料為大豆，通過多種曲霉發酵制成[1-2]，黃豆醬的顏色為紅棕色或者紅褐色，表面具有光澤，有醬香味和脂香味[3]。豆醬中富含營養物質，一類是由大豆原料組成，含有大豆中的消化酶、異黃酮、蛋白質、維生素、膽堿和胰蛋白酶等；另一類則是在發酵和加工過程中產生的肽類和類黑精等[4-5]，這些營養物質能改善和增強機體免疫功能[6-7]，極易被吸收，深受消費者的喜愛[8]。

隨著社會的發展，食品的分析檢測方法不斷地提高，標準化生產醬類產品已經成為必然趨勢。隨著近年來對醬類產品研究的深入，豆醬中的生物活性功能物質不斷被發現，其價值也不斷被提高[9-11]。

長時間以來，采用傳統加工工藝的豆醬在市場上有著主導地位，主要是由于該種方式生產豆醬需要的技術水平很低，需要的設備簡單，容易操作。但是該種加工工藝也存在一定的缺陷，豆醬發酵周期長，劣質產品層出不窮[12]，很大程度上影響了豆醬的名譽，為豆醬產業的發展帶來一定的阻力[13-14]。

豆醬發酵過程中微生物種類復雜，并且微生物的發酵伴隨著較多的化學變化，很難清晰呈現[15]。傳統的豆醬加工主要依靠環境中的微生物進行發酵，通過此方式生產豆醬需要6～10個月，使得豆醬的生產成本較高，很大程度上阻止了豆醬產業的發展[16-17]。

本研究基于此，對傳統豆醬發酵過程中微生物的多樣性和理化性質進行研究，旨在為今后豆醬的標準化和規模化生產提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 原材料與試劑

面粉：河南面粉廠；牛肉膏：上海生化制藥廠；大豆：購于當地農貿市場；甘露糖、木糖、阿拉伯糖：Sigma公司；酵母粉：上海生化制藥有限公司；胰蛋白胨：上海生物試劑有限公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂和麥芽汁。

1.2 試驗儀器

恒溫培養箱、手提式壓力消毒器、恒溫振蕩器、MP512-01型精密pH計 上海三信儀表廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆醬自然發酵工藝

1.3.1.1 大豆浸泡

取大豆100 kg，去雜質和泥沙，之后放入池子中浸泡，加水浸泡超過豆面5 cm，大豆浸泡10 h，直至豆醬本身的重量升高至原來的2～3倍，待豆粒膨脹無皺紋，將水放掉，濾干備用。

1.3.1.2 蒸豆

將大豆放入鍋中蒸2 h，直到大豆熟透而不爛，豆子無硬心為宜。

1.3.1.3 自然發酵

把蒸熟的大豆出鍋，放至80 ℃時，將75 kg面粉與大豆混合均勻，放于室內，依靠自然界中的微生物進行自然發酵。當看到豆醬表面有白色菌絲，并且有少量的淡綠色孢子，同時具有曲香味時即可。之后加入5%的鹽水，混合均勻后自然晾曬，每星期翻醬2～4次，時間為90～120 d，即可制成。

1.3.2 豆醬發酵過程中微生物的分離和培養

在豆醬發酵的過程中，每個階段進行樣品采集，采用稀釋涂布法，把豆醬中的微生物進行分離和培養。

1.3.3 微生物的分類及檢索鑒定

根據菌落形態特征進行歸類，選取單一的菌落，采用劃線方式進行純化。初步鑒定細菌的種類，根據《伯杰氏細菌系統分類學手冊》、《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》等相關文獻進行分類鑒定。

1.3.4 氨基態氮的測定

氨基態氮是由氨基和羧基構成，它們相互中和，成為中性鹽，當甲醛溶液加入時，氨基和甲醛的親和性更高，從而中和，使得溶液的羧基單獨游離出來，導致溶液成為堿性，采用酸堿滴定法，測定氨基態氮含量來間接測定豆醬中氨基酸含量[18]。

1.3.5 pH值和總酸度的測定

pH值的測定：采用精密pH計其進行檢測。

總酸度的測定：使用氫氧化鈉標準液進行中和滴定，并以酚酞指示其滴定終點。

1.3.6 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定：采用福林-酚試劑法[19]。

2 結果與討論

2.1 豆醬發酵過程中酸度和pH的變化

在自然條件下，豆醬發酵過程中總酸度和pH值隨著發酵時間的延長而變化，見圖1。

圖1 豆醬發酵過程中pH值和酸度的變化

由圖1可知，發酵開始時，豆醬中的酸性物質較少，此時的豆醬pH為7，豆醬中的酸度為0。隨著發酵時間的增長，豆醬中的微生物不斷地繁殖和產酸，使得豆醬中的酸度快速增長。當發酵時間小于20 d時，豆醬中的酸度快速增加，隨著發酵時間的延長，酸度增加的速度逐漸減緩。當發酵時間達到120 d時，豆醬中的酸度和pH值不再發生改變。

2.2 豆醬發酵過程中蛋白酶活力和氨基態氮的變化

由圖2可知，隨著發酵時間的增長，豆醬中的蛋白酶活為呈現先增加后降低的趨勢，當發酵時間小于20 d時，豆醬中的蛋白酶活隨著發酵時間的增長而快速增長。當發酵時間為20～60 d時，雖然豆醬中的蛋白酶活也在增長，但是增長的速度明顯減緩。當發酵時間大于60 d時，豆醬中的蛋白酶活隨著發酵時間的延長而逐漸降低。

圖2 豆醬中蛋白酶活力和氨基態氮隨時間的變化情況

豆醬中的氨基態氮隨著發酵時間的增長而逐漸增長，當發酵時間小于20 d時，豆醬中的氨基態氮快速增長。當發酵時間大于20 d時，隨著發酵時間的延長，豆醬中氨基態氮增長的速度雖然明顯減緩，但還具有一定的增長幅度。

2.3 豆醬發酵過程中微生物多樣性分析

在豆醬發酵的不同時間，分別對不同發酵時期的樣品進行采樣，對微生物的菌株進行純化。根據分離的菌株菌落形態進行歸類。不同的發酵時間，豆醬中微生物的多樣性差異較大。不同時期豆醬中微生物多樣性見表1。

表1 豆醬發酵的不同階段體系中微生物的組成

由表1可知，隨著發酵時間的增長，豆醬中的霉菌、酵母菌和細菌所占的比例均發生改變。但是無論是哪一種菌，都呈現出先增長后降低的趨勢。這是由于發酵開始時豆醬中的環境比較適合微生物的生長，隨著發酵時間的增長，豆醬中的酸度逐漸增加，整個環境不適合微生物的生長和繁殖，所以微生物的比例逐漸降低。

將豆醬發酵分為3個發酵階段：第一階段為第1天～第15天，第二階段為第15天～第60天，第三階段為第60天～第180天。

圖3 豆醬發酵過程中3個階段微生物多樣性分析

在第一階段發酵過程中，由于發酵剛剛開始，豆醬中微生物種類受環境影響明顯，此時，環境中微生物種類是決定豆醬品質的關鍵。該階段豆醬中的霉菌占主要優勢。霉菌種類有米曲霉、醬油曲霉、高大毛霉和黑曲霉。微生物在豆醬上生長，此過程中，微生物會分泌各種蛋白酶和淀粉酶，使豆醬中的蛋白質水解成多肽和氨基酸，為后期微生物的生長發酵提供了基礎。

第二階段的發酵需要添加鹽水。高鹽環境和缺氧條件導致豆醬中的霉菌停止了生長，但霉菌分泌的蛋白酶和淀粉酶能夠繼續水解蛋白質和淀粉。同時豆醬中的乳酸菌和酵母菌快速繁殖，產生乙醇、乳酸和醋酸等產物，由于有機酸的積累，豆醬中的pH值不斷下降，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性逐漸被削弱。

第三階段的發酵為豆醬的成熟階段，豆醬中的酸性成分和酒精不斷積累，導致豆醬中的微生物停止生長，但一些基本的代謝功能還保留著，隨著豆醬發酵時間的不斷延長，豆醬中的酸性逐漸降低，不適合微生物的生長和繁殖，微生物數量開始逐漸減少，直到趨于穩定，微生物的種類基本保持一致，此階段是豆醬風味形成的關鍵階段。

2.4 不同霉菌菌株的蛋白酶活力

蛋白酶活力是菌株質量品質的重要指標，其能力的強弱對豆醬的發酵具有重大意義，將4種菌株接種于大豆培養基上，放于室溫下培養2 d，進行蛋白酶活力測定，結果見圖4。

圖4 不同霉菌蛋白酶活力

由圖4可知，不同的霉菌的蛋白酶活力存在一定的差異。其中米曲霉和黑曲霉的蛋白酶活力更強，醬油曲霉和高大毛霉的蛋白酶活力相對較弱。如果使用蛋白酶活力較高的菌株，則可以獲得風味更佳的豆醬。

3 小結

品質較高的豆醬發酵劑主要來源于風味較佳的豆醬。發酵劑的品質決定著豆醬的口感、風味和香氣等感官特征[20]。所以，選擇優良的發酵劑對豆醬發酵十分重要。因此，為獲得品質優良的豆醬，研發豆醬發酵過程中微生物的變化至關重要。本研究通過研究豆醬發酵過程中微生物的多樣性，為研究適合的人工菌種發酵豆醬奠定了基礎。