基于纖維素酶酶解對虎掌菌破壁工藝優化

李澤林,王秋婷,桂海佳,谷大海,王雪峰,肖智超,王桂瑛,普岳紅,范江平

(云南農業大學 食品科學技術學院,昆明 650201)

目前，菌類因其獨特的鮮美滋味(如野生菌與人工養殖菌)被國內外越來越多地用于生產制作極具菌香風味的調味料。郭磊等[1]以云南美味牛肝菌為基料研制了菌香調味料，并分析了其營養成分。清源[2]以新鮮塊菌為原材料對其護色以及酶解工藝進行了優化，并在此基礎上研制出了獨具風味的塊菌調味醬。Simanungkalit等[3]以平菇為材料研制了調味品并對其品質的影響因素進行了分析。以菌類為基料研制的調味品不僅具有獨特的菌香味，而且還很大程度地保留了它們的營養成分，具有較大的研究前景。

虎掌菌又名棗翹鱗肉齒菌(Sarcodonimbricatus(L.)P.Karst.)，菌體一般呈黑褐色，以菌蓋有塊狀鱗片、形狀像虎爪而得名[4]。虎掌菌菌肉醇厚芳香且略帶苦味，可入藥，已有研究證明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等生物活性作用[5-6]。其含有豐富的礦質元素，高蛋白、低脂肪并且含有多種人體必需的氨基酸，其與非必需氨基酸比例適宜，且含有一定濃度的呈味氨基酸，具備制作調味基料優良的前提條件[7-9]。

但是，食用菌的細胞壁主要由葡聚糖、幾丁質、蛋白質、少部分木質素和纖維素組成，與植物細胞壁不同[10]。食用菌的細胞壁對細胞有支撐的作用，如維持生長發育過程中細胞的形狀，為細胞抵御外界滲透壓、機械力提供保護，還可以保持細胞內水分，防止野生菌組織衰老與軟化等[11-12]。另外，食用菌細胞壁的幾丁質和蛋白質可以聚合在一起形成聚合物網狀結構，從而防止細胞內成分流出[13]，可見細胞壁對食用菌的生長發育至關重要[14-15]，然而細胞壁的這些結構導致在調味品研制的過程中風味物質的釋放受阻以及滋味物質(如游離氨基酸、還原糖)的形成減少，從而影響調味品的最終口感。因此，在研制調味品的前期階段對食用菌進行破壁處理是關鍵且必要的。

所以，為了更好地協助釋放虎掌菌的菌香味物質，本研究擬以虎掌菌為原材料并以還原糖含量為檢測指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面優化設計纖維素酶酶解對虎掌菌破壁工藝進行優化，旨在為虎掌菌的風味物質釋放以及以虎掌菌為調味基料的調味品的深入研究提供試驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎掌菌：新鮮、無病蟲害及瑕疵，購于云南省易門縣，經鼓風干燥箱烘干，打粉機粉碎過60目篩后放置于干燥器中備用。

纖維素酶(食品級，50000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸(分析純)：廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；氫氧化鈉(分析純)、丙三醇(分析純)、葡萄糖(分析純)：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 設備

T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；JC-SY型電熱恒溫水浴鍋 上海成順儀器儀表有限公司；VYJG-9420型鼓風干燥箱 杭州億捷科技有限公司；DXF-02C型打粉機 廣州大祥電子機械設備有限公司。

1.3 工藝流程

準確稱取虎掌菌干粉→加水混勻→調節pH→加入纖維素酶→調節溫度→酶解→檢測還原糖含量。

操作要點：根據單因素試驗條件調節pH為4.5～6.0；調節溫度為選取水浴酶解溫度40～55 ℃，保證同一條件下溫度恒定。

1.4 單因素試驗

以還原糖含量為指標，分別選取溫度(40，45，50，55 ℃)、時間(1，1.5，2，2.5 h)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、酶添加量(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)、pH(4.5，5.0，5.5，6.0)進行單因素試驗。

1.5 響應面設計

根據單因素試驗結果，選取三因素三水平響應面優化設計，其因素水平表見表1。

表1 響應面設計因素水平表

1.6 還原糖含量測定

參照時培寧等[16]和王莉麗等[17]的方法，以還原糖含量為指標，采用DNS法測定纖維素酶對虎掌菌破壁的效果。

1.6.1 DNS試劑的配制

稱取3.25 g 3,5-二硝基水楊酸，加少量水溶解后，轉移至500 mL棕色容量瓶中，加入162.5 mL的氫氧化鈉溶液(2 mol/L)和22.5 g丙三醇，溶解混勻。

1.6.2 葡萄糖標準液的配制

稱取1.000 g的葡萄糖，加水溶解并定容至1000 mL后，分別取出0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mL于試管中，加水至0.5 mL，再加入1.5 mL的DNS試劑，混勻后沸水浴5 min，冷卻后再加入4 mL的蒸餾水，混勻后靜置20 min，在540 nm處測定吸光值。

1.6.3 樣品測定

取1.0 mL的稀釋液于試管中，吸取1.5 mL的DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后再加入4 mL的蒸餾水，放置20 min，在540 nm處測定吸光值。

1.7 數據分析

每次試驗均重復3次，使用Design Expert設計響應面試驗，GraphPad Prism 9制作條形圖，Excel 2016處理數據。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶酶解時間對虎掌菌破壁效果的影響

在溫度50 ℃、料液比1∶15、pH 5.5、酶添加量0.4%的條件下，由圖1可知，隨著時間的延長，還原糖含量不斷增加，當時間達到2 h時，還原糖含量最高(P<0.05)。這是因為隨著時間的增加，纖維素酶對細胞壁的作用不斷加大，使其分解產生還原糖，當底物完全被消耗后，即使增加時間，還原糖含量也不會再增加。因此，2 h為最佳酶解時間。

圖1 時間對纖維素酶酶解效果的影響

2.2 纖維素酶酶解溫度對虎掌菌破壁效果的影響

酶解時間為2 h，其他條件不變。由圖2可知，溫度在40～50 ℃時，還原糖含量不斷增加，在50 ℃時達到最大值(2.03±0.05)%(P<0.05)，之后還原糖含量開始下降(P<0.05)。這是因為溫度不斷升高，刺激酶的活性，使酶活性提高，從而對細胞壁的分解能力增強，不斷產生還原糖；但超過一定的溫度時，部分酶蛋白分子失活變性。張名佳[18]的研究表明，溫度為50 ℃時，纖維素酶的穩定性較好，與本試驗結果一致。因此，最適酶解溫度是50 ℃。

圖2 溫度對纖維素酶酶解效果的影響

2.3 纖維素酶酶解pH對虎掌菌破壁效果的影響

溫度為50 ℃，其他條件不變。由圖3可知，pH從4.5升至5.5時，還原糖含量不斷增加(P<0.05)，并且達到最大值(2.10±0.03)%，當pH大于5.5時，還原糖含量開始顯著減少(P<0.05)。這是因為pH影響著酶的活性，適宜的pH有利于酶和底物結合[19]。因此，最適酶解pH值為5.5。

圖3 pH對纖維素酶酶解效果的影響

2.4 纖維素酶添加量對虎掌菌破壁效果的影響

pH為5.5，其他條件不變。由圖4可知，隨著酶添加量的增加，還原糖含量先增加后減少，酶添加量在0.4%時還原糖含量達到最大值(P<0.05)。這是因為酶的濃度受到添加量的影響，隨著酶濃度的增加，纖維素酶酶解速率增加，導致還原糖含量增大，但當添加量過多時，酶的濃度達到飽和狀態，抑制了酶解作用。因此，0.4%為酶的最適添加量。

圖4 酶添加量對纖維素酶酶解效果的影響

2.5 料液比對虎掌菌破壁效果的影響

酶添加量為0.4%，其他條件不變。由圖5可知，當料液比為1∶20時，還原糖含量達到最大值(P<0.05)，隨后開始下降，總體呈現先上升后下降的趨勢。這是因為適當的底物濃度，使酶能夠完全與底物結合，充分水解，達到最優酶解效果；過高的底物濃度會使酶的濃度下降，導致酶解的反應速率降低，難以酶解濃度高的物質[20]。因此，最佳料液比為1∶20。

圖5 料液比對纖維素酶酶解效果的影響

2.6 響應面試驗結果分析

2.6.1 試驗設計結果及回歸方差分析

根據單因素試驗的結果，在溫度為50 ℃、pH為5.5的條件下，利用響應面對纖維素酶破壁工藝進一步優化，設計方案及結果見表2。

表2 試驗設計與結果

對表2中數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型方程為：Y=2.15+0.17A+0.11B-0.046C-0.021AB-0.29AC-0.22BC-0.14A2-0.36B2-0.22C2。

由表3可知，模型的P<0.01，且失擬項的P=0.1936>0.05，說明擬合度好，此模型可用。該回歸模型的絕對系數R2=0.9717，RAdj2=0.9353，相差較小，說明此模型可用于分析纖維素酶破壁的工藝優化。回歸方程一次項A、B，交互項AC、BC，二次項B2、C2對還原糖含量的影響極顯著(P<0.01)，二次項A2對還原糖含量的影響顯著(P<0.05)。根據各因素顯著水平，結合F值大小可以判斷酶解時間、酶添加量、料液比3個因素對還原糖含量的影響順序為酶解時間>酶添加量>料液比。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗

2.6.2 響應曲面與等高線分析

響應曲面圖和等高線圖能夠反映各因素影響程度的大小。由圖6中a可知，響應曲面圖的坡面陡峭，酶解時間的等高線密集程度較高，說明酶解時間對還原糖含量的影響比酶添加量的影響顯著。由圖6中b可知，隨著酶解時間和料液比的增大，還原糖含量先增大后減小，酶解時間與料液比對還原糖含量的影響顯著，并且二者的交互項顯著。由圖6中c可知，隨著酶添加量和料液比的增大，還原糖含量先增大后減小，酶添加量與料液比對還原糖含量的影響顯著，并且二者的交互項顯著。

圖6 各因素交互作用響應曲面及等高線圖

2.7 纖維素酶破壁最優工藝及驗證試驗

通過模型得到的最優結果：pH為5.5，溫度為50 ℃，酶解時間為2.5 h ,酶添加量為0.44%，料液比為1∶15.17，還原糖含量為2.36%。根據此工藝條件進行3組驗證試驗，得出還原糖含量的平均值為(2.28±0.03)%，與理論值相比誤差小，說明該優化結果具有可行性。

3 結論

虎掌菌滋味鮮，美含有豐富的蛋白質、氨基酸以及對人體有益的微量元素，是制作獨特菌味調味料優質的原材料。本研究以虎掌菌為材料，在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗優化，得到最佳破壁條件為：pH 5.5、溫度50 ℃、酶解時間2.5 h、酶添加量0.44%、料液比1∶15.17，此條件下，還原糖含量的平均值為(2.28±0.03)%，與理論值2.36%接近，說明該優化結果具有可行性。