河北省某野生動物園園養動物人五毛滴蟲感染調查

梅汝蕃，林小雨，孫通寶，潘素敏，陳麗鳳，張華英，王秋悅

(1. 河北科技師范學院動物科技學院 河北省預防獸醫重點實驗室，河北 秦皇島 063000 ； 2. 河北省沙河市第一中學，河北 沙河 054100)

人五毛滴蟲是一種人獸共患寄生蟲，主要在人、犬、貓、靈長類和嚙齒類動物的消化道內寄生[1]。過去通常認為人五毛滴蟲是宿主腸道內共生生物，但是近些年國內外陸續出現從腹瀉動物體內分離到人五毛滴蟲的報道[2]，另有報道表明其可引起人類腹瀉、肺部感染、類風濕關節炎等[3]。人五毛滴蟲可能為一種新發的傳染性疾病病原，具有人獸共患和水源傳播的潛力，其公共衛生學意義重大。然而，雖然已經認識到人五毛滴蟲作為哺乳動物病原體的潛在危險，但目前關于中國野生動物的人五毛滴蟲流行病學調查研究較少。因此，本試驗主要對河北省某野生動物園園養野生動物進行人五毛滴蟲的感染情況調查，以更好地確定人和動物感染的風險和動態。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2019年12月—2020年4月從河北省某野生動物園收集了88份動物糞便樣品，共包含32種動物，其中草食動物70份(表1)，肉食動物18份(表2)。

1.2 主要材料 糞便基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；DL2 000 DNA Marker、dNTP Mix和Loading Buffer，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 形態結構觀察

1.3.1 直接涂片法 在潔凈的載玻片中央置1滴生理鹽水，用牙簽挑取米粒大小的糞便，在生理鹽水中涂抹均勻，去掉多余殘渣，蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余水分吸掉，置于光學顯微鏡下觀察。首先通過形態學對糞便進行初步篩選，收集并培養含有疑似毛滴蟲的樣品。

1.3.2 碘液染色法 置1滴碘液在載玻片上，用牙簽挑取少許糞便涂勻在碘液中，除去多余殘渣，最后加蓋玻片，置光學顯微鏡下觀察。

1.4 糞便基因組的提取及PCR檢測 使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品DNA，-20 ℃保存備用。根據GenBank中登錄的人五毛滴蟲18S rRNA基因序列(KX136894)設計引物，引物序列為RWMDC18S-F：5′-TGTAAACGATGCCGACAG-AG-3′，RWMDC18S-R：5′-CAACACTGAAGCCAATG-CGAGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系(20 μL)：2×EsTaqMaster Mix(Dye)10.0 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應條件：94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 人五毛滴蟲18S rRNA基因序列同源性及遺傳進化分析 將PCR陽性產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果與GenBank中登錄的人五毛滴蟲18S rRNA序列進行同源性分析；利用MEGA 7.0構建人五毛滴蟲18S rRNA基因的系統發育進化樹。

2 結果

2.1 形態結構觀察 直接涂片法結果如圖1A、1B所示，在低倍鏡下可觀察到大量快速游動的蟲體，高倍鏡下可見蟲體呈半透明卵圓形或梨形。當蟲體活性良好時做原地旋轉運動，或呈螺旋狀前進，游動迅速；當培養基營養被大量繁殖的蟲體過度消耗時，蟲體活性減弱，鏡下可觀察到蟲體游動明顯減慢或停止，形狀近似變為圓形。碘液染色法結果如圖1C所示，能清晰地看到蟲體鞭毛結構，有時可見波狀膜。從鏡檢結果可初步判定蟲體為毛滴蟲，且蟲體活性較強。

圖1 毛滴蟲顯微鏡觀察

2.2 人五毛滴蟲18S rRNA的PCR擴增 經PCR檢測，88份糞便樣品中人五毛滴蟲18S rRNA基因陽性樣本共5份，總陽性率為5.7%。其中，70份草食動物(共15種)樣品中檢測出毛滴蟲3份，陽性率為4.3%(表1)；18份肉食動物(共7種)樣品中檢測出毛滴蟲2份，陽性率為11.1%(表2)。

表1 草食動物人五毛滴蟲感染情況

表2 肉食動物人五毛滴蟲感染情況

2.3 毛滴蟲18S rRNA基因序列同源性及遺傳進化分析 將PCR擴增的5份陽性樣品基于18S rRNA基因測序后所獲得的序列，通過NCBI的BLAST檢索系統進行比對，構建系統進化樹，如圖2所示，5份陽性樣品(命名為TSMDC 1～TSMDC 5)18S rRNA基因與GenBank中登錄的人五毛滴蟲基因序列MH997492、MH997493、MF991102、KX833161、KM205213、KJ404269和KX136886處于同一分支，且相似性高達99%，因此本試驗在野生動物體內檢測到的蟲體確定為人五毛滴蟲。該進化分支中選用的人五毛滴蟲基因分別來源于動物豬、山羊、犬類、獼猴等，說明人五毛滴蟲感染動物種類的多樣性，草食動物和肉食動物均可感染人五毛滴蟲。本試驗所測得序列TSMDC 1～TSMDC 5均發生了輕微的等位基因突變，第96位堿基發生變化(C96T)。

圖2 基于人五毛滴蟲18S rRNA序列同源性構建的系統發育進化樹

3 討論

近些年出現了越來越多的關于人五毛滴蟲感染動物的報道，包括豬、羊、牛、犬、貓、非人靈長類、嚙齒類等動物，說明人五毛滴蟲宿主范圍明顯在不斷擴大。Dimasuay等發現，蟒蛇、角鸮、山羊均可作為人五毛滴蟲的感染宿主[4]。2014年Li等首次報道豬為人五毛滴蟲的新宿主[5]。Li等在水牛和黃牛體內分離到人五毛滴蟲蟲株[6]。董兵等從東北的鹿腸道內分離到人五毛滴蟲，而且感染率高達50%(34/68)[7]。王秋悅等從腹瀉貉子體內分離得到人五毛滴蟲[8]。而且也有從人體分離到人五毛滴蟲蟲株的報道[9]。最新的研究發現，在癌癥患者中人五毛滴蟲感染率明顯多于健康人群，而且人五毛滴蟲導致胃腸道發生腫瘤的風險增加了6.75倍[10]。人五毛滴蟲已成為人獸共患寄生蟲病的潛在重要病原體，且其具有較強的新宿主適應力。相信隨著研究的深入，會發現越來越多的人五毛滴蟲新宿主。

本試驗對河北省某野生動物園園養野生動物中人五毛滴蟲的感染情況進行了調查。結果顯示，該野生動物園中野生動物存在人五毛滴蟲感染，草食動物感染率為4.3%，肉食動物感染率為11.1%，肉食動物的感染率要高于草食動物?？傮w來說，該園野生動物人五毛滴蟲感染率不高，主要是由于該動物園管理較為規范，且定期進行驅蟲。根據我國的文獻報道，人五毛滴蟲在不同地區的不同物種中的感染率都不盡相同。Li等調查了吉林省野生動物(包括梅花鹿、獺兔、藍狐、銀狐、浣熊狗和水貂等動物)的人五毛滴蟲感染情況，感染率介于16.25%～53.33%，感染率最高的為浣熊狗[11]。Li等對中國中東部地區綿羊和山羊進行了人五毛滴蟲流行病學調查，發現感染率分別為6.0%和0.3%[12]。柳佳等對河北省毛皮動物貉子體內人五毛滴蟲的感染情況進行了初步調查，發現腹瀉貉子中有30%以上均有人五毛滴蟲的感染[13]。

本試驗發現，該動物園中的梅花鹿、黇鹿、驢和長臂猿存在人五毛滴蟲感染，這些動物雖未表現任何明顯臨床癥狀，但這些無癥狀感染動物體內寄生蟲病的防控尤為重要，因其可將病原廣泛傳播而被忽視。在動物園中飼養員、管理員、獸醫工作者、游客等人員均有機會與野生動物密切接觸，由于人五毛滴蟲的人獸共患性和宿主廣泛性，應積極檢測動物園中野生動物的人五毛滴蟲感染情況；定期對其生活環境進行清理和消毒，對糞便、臟物進行及時清除；關注動物健康狀態，對出現腹瀉癥狀的動物進行隔離和治療；進行預防性驅蟲，防止寄生蟲感染和傳播。