葡萄糖酸氯己定噴霧劑的制備及含量測定

王 楠，劉心潤，周華林，吳仲元，邱銀生

(1.武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北 武漢 430023 ； 2. 襄陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，湖北 襄陽 441100)

氯己定具有相當(dāng)強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌作用，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和幾種真菌均有效，在皮膚上有長效抗菌性能[1-5]。氯己定與鹽酸、醋酸和葡萄糖酸結(jié)合成鹽,分別形成鹽酸氯己定、醋酸氯己定(Chlorhexidine diacetate，CHD)和葡萄糖酸氯己定(Chlorhexidine gluconate，CHG)。鹽酸氯己定因在水中溶解度較低，目前已經(jīng)基本被淘汰。由于CHD的刺激性和致敏性比CHG大，因此，國外近年來的研究主要集中在CHG方面[6]。

西班牙Bioiberica公司研究開發(fā)的CHG噴霧劑，商品名Klorexivet?，可用于治療犬、貓破潰傷口、皮炎、細(xì)菌和真菌性感染，效果良好[7]。為了開發(fā)寵物用CHG噴霧劑，本試驗應(yīng)用正交設(shè)計方法，篩選得到CHG噴霧劑的最優(yōu)處方，并用高效液相色譜法(High-performance liquid chromatography,HPLC)測定按最優(yōu)處方制備的CHG噴霧劑的含量，結(jié)果表明，制備的CHG噴霧劑質(zhì)量符合要求，測定CHG噴霧劑含量的HPLC精密度和重復(fù)性好，含量測定方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，能有效控制CHG噴霧劑的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 CHD對照品，購自河南萬佳標(biāo)物公司；對氯苯胺對照品，購自Sigma-Aldrich?上海貿(mào)易有限公司；薄荷醇和麝香草酚，均購自上海麥克林生化科技有限公司；20% CHG，購自武漢市榮燦生物科技公司；其余試劑為分析純。

1.2 主要儀器 酸度pH計(E-301-D型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；721可見分光光度計(天津市普瑞斯儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Waters-2489型)、紫外吸收檢測器(Waters-2487型)和自動進(jìn)樣器(Waters-2707型)，均為美國Waters公司設(shè)備。

1.3 CHG噴霧劑處方優(yōu)化試驗設(shè)計 Klorexivet?處方中含有麝香草酚、L-薄荷醇和乙醇等輔料，參照參考文獻(xiàn)[7-9]方法，采用正交試驗設(shè)計對CHG噴霧劑處方進(jìn)行優(yōu)化，影響CHG噴霧劑透光率T、穩(wěn)定性和pH的主要因素為薄荷醇的用量(A)、麝香草酚的用量(B)和95%乙醇的用量(C)，選取A、B和C作為考察因素，正交試驗設(shè)計因素水平見表1。以CHG噴霧劑的透光率T、穩(wěn)定性和pH為指標(biāo)，設(shè)計CHG噴霧劑制備處方優(yōu)化的L9(33)正交試驗[10-12]，試驗1～9的各因素水平組合的正交試驗安排見表2。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平

表2 正交試驗安排

1.4 CHG噴霧劑的含量測定 參照潘學(xué)營[13]和范馨等[14]的方法，采用HPLC測定CHG噴霧劑的含量。

2 結(jié)果

2.1 CHG噴霧劑的制備

2.1.1 CHG噴霧劑制備處方優(yōu)化試驗1～9的試驗結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果

2.1.2 試驗數(shù)據(jù)驗證 用田口設(shè)計方法[15]進(jìn)行統(tǒng)計分析得到最優(yōu)處方組合為A1B1C3，按最優(yōu)處方進(jìn)行3次驗證試驗，制備的CHG噴霧劑穩(wěn)定性都為3，透光率T分別為98.4%、98.3%、98.5%，pH均合格。

2.1.3 CHG噴霧劑的制備 根據(jù)最佳處方組合A1B1C3，稱取薄荷醇和麝香草酚各5 g，加入95%乙醇500 mL溶解，加入20% CHG溶液100 mL，去離子水加至1 000 mL，攪拌溶解至澄清透明，灌封于100 mL PET塑料噴霧瓶中制得CHG噴霧劑。

2.2 HPLC測定CHG噴霧劑的含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 HPLC色譜條件具體為：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈：磷酸鹽溶液(無水磷酸氫二鈉0.1 mol/L，三乙胺0.05 mol/L，用磷酸調(diào)pH至3.0)(32.5∶67.5)為流動相，紫外檢測波長235 nm，柱溫40 ℃。結(jié)果顯示，在此條件下系統(tǒng)適用性良好，CHD峰與對氯苯胺峰分離度大于3，兩峰峰型對稱因子為0.91，理論塔板數(shù)大于2 000。見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜

2.2.2 專屬性考察 分別配制50 μg/mL的乙醇溶液、薄荷醇溶液、麝香草酚溶液、薄荷醇、麝香草酚混合溶液、CHD對照品溶液[14]和CHG供試品溶液，進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，所用輔料對CHG的測定均無干擾。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取CHD對照品，制成 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL和100.0 μg/mL的溶液，分別進(jìn)樣測定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，線性回歸方程為Y=23 207X+1 524.3，r=0.999 8，CHD在濃度為1～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 CHD濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4 準(zhǔn)確性試驗 按處方配制成氯己定濃度分別為40、50 μg/mL和60 μg/mL的3種溶液，9次測定的回收率平均值為100.11%，RSD為1.73%，RSD小于2.0%，表明輔料對含量測定無影響。

2.2.5 精密度試驗 取CHD對照品配制成濃度為50 μg/mL的溶液，重復(fù)進(jìn)樣9次，RSD為0.20%，RSD小于2.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 CHG噴霧劑供試品稀釋成濃度為50 μg/mL的溶液6份，分別進(jìn)樣1次，RSD為0.32%，RSD小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 CHG噴霧劑供試品稀釋成濃度為50 μg/mL的溶液，于0、2、4、8、12 h和24 h測定，RSD為0.84%，RSD小于1.0%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 樣品含量測定 取3批試驗樣品進(jìn)行測定，按外標(biāo)法計算各批樣品的相對標(biāo)示量分別為100.1%、99.8%和97.4%。

3 討論

3.1 CHG噴霧劑的處方優(yōu)化 正交試驗設(shè)計常應(yīng)用于技術(shù)開發(fā)階段，可以用較少的組合評估較多的試驗因素，減少試驗次數(shù)，縮短研制開發(fā)周期，提高效率，適用于獸用藥品研究領(lǐng)域[16-18]。本試驗以CHG噴霧劑的透光率T、穩(wěn)定性和pH為指標(biāo)，設(shè)計L9(33)正交試驗，優(yōu)選出的最佳處方組合為薄荷醇的用量0.5 g、麝香草酚的用量0.5 g和95%乙醇的用量50 mL。按篩選所得的最優(yōu)處方制備的CHG噴霧劑穩(wěn)定性好，透光率高，pH都合格。

3.2 CHG噴霧劑的制備 氯己定因毒性低、刺激性小，能殺滅各種細(xì)菌繁殖體，抑菌能力比其他消毒劑強(qiáng)，低濃度氯己定也有很強(qiáng)的抑菌作用，而且還具有累積活性，是臨床作為皮膚黏膜消毒較理想的消毒劑[19-20]。乙醇是一種廣泛用于臨床的消毒劑，殺菌效果好，作用快速，對真菌和結(jié)核桿菌都有很強(qiáng)的殺滅效果。氯己定與乙醇配伍可起到協(xié)同作用，增強(qiáng)殺菌效果[19,21]。美國生產(chǎn)的CONZOL(1%)和MICONAZOLE NITRATE(1%)兩種硝酸咪康唑噴霧劑中乙醇含量都達(dá)到了55%，故優(yōu)化得到的處方中乙醇含量50%和上述公司的濃度基本一致。處方中的麝香草酚具有防腐性，還具有抗真菌和寄生蟲功能；L-薄荷醇也可用作殺菌劑[22]。本試驗篩選所得的CHG噴霧劑處方配伍合理、穩(wěn)定性好、殺菌譜廣，可填補(bǔ)寵物用消毒殺菌劑的空白，具有良好的市場前景。

3.3 CHG含量測定 在含量測定的色譜條件試驗中，采用了Waters Xbridge C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)柱、Waters symmetry?C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)柱、Waters Xbridge C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)柱和Diamonsil C18(2)(5 μm，250 mm×4.6 mm)柱4種色譜柱[23-24]。流動相選擇有梯度洗脫和等度洗脫2種方法，方法一參考中國藥典方法[25]流動相梯度洗脫，使用Diamonsil C18(2)(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱時，醋酸氯己定和對氯苯胺兩物質(zhì)峰型均較寬、拖尾、不對稱，12 min后出現(xiàn)雜峰，基線不平。方法二參考潘學(xué)營[13]的等度洗脫方法，使用Diamonsil C18(2)(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱和Waters XBridge?C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱時，醋酸氯己定和對氯苯胺兩物質(zhì)分離度較好，峰型符合標(biāo)準(zhǔn)。通過試驗比較分析，最終采用的色譜條件為Diamonsil 5 μm C18(2)(250 mm×4.6 mm)色譜柱，本試驗采用方法二推薦的等度洗脫法，專屬性強(qiáng)，精密度好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以滿足CHG噴霧劑產(chǎn)品的含量測定需要。