油佐劑口蹄疫疫苗稀釋豬瘟和豬偽狂犬病活疫苗混合免疫的效果評價

季 霖，宋慶慶，王 凱，佘志成，徐希蘭，袁兵兵，藺輝星

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095 ； 2. 獸用疫苗國家工程實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030 ；3. 金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030 ； 4. 邳州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 邳州 221399 ；5. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

當前在非洲豬瘟威脅之下[1-3]，為減少接觸次數(shù)，降低風險，作為生物安全方案的補充，一些豬場紛紛重構(gòu)場內(nèi)免疫程序，接受多種疫苗混合注射的方案。不同疫苗適時混合注射有很高的便利性，但混合使用是否能達到單獨使用相同水平的免疫效果，值得深入評估。豬口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)、豬偽狂犬病(Swine pseudorabies,PR)和豬瘟(Classical swine fever，CSF)在我國流行廣泛，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要的病毒性傳染病，針對這3種疫病的疫苗也是各個豬場必須免疫的疫苗[4-6]，在常規(guī)的免疫程序中，這3種疫病的疫苗免疫時間較接近，也是混合免疫中使用最多的方案。

在疫苗研發(fā)過程中，有學者在篩選豬偽狂犬病活疫苗佐劑的過程中證實，相對于生理鹽水和PBS溶液，油佐劑對活疫苗免疫后抗體的產(chǎn)生有促進作用[7]。本研究以60日齡商品豬為研究對象，將豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗與豬瘟活疫苗和豬偽狂犬活疫苗這3種疫苗混合進行免疫接種，分析其是否具有協(xié)同免疫效果，為臨床科學使用獸用疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 油佐劑豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)，購自金宇保靈生物藥品有限公司(批號：20339016)，100 mL/瓶(50頭份/瓶)，乳白色略帶黏滯性乳狀液，2～8 ℃保存。豬偽狂犬病耐熱保護劑活疫苗(C株)，購自揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司(批號：20225048)，凍干苗，50頭份/瓶，淡黃色海綿狀疏松團塊，2～8 ℃保存。豬瘟ST傳代細胞苗，購自遼寧益康生物藥品有限公司(批號：21335015)，凍干苗，50頭份/瓶，淡黃色海綿狀疏松團塊，2～8 ℃保存。FMDV-Ab檢測試劑盒(批號:2021E23-005)，購自內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司；PRVgB-Ab檢測試劑盒，購自荷蘭百測(BioChek)公司(批號:FS8117)；PRVgE-Ab檢測試劑盒(批號:AT069)和CSFV-Ab檢測試劑盒(批號:AB421)，均購自IDEXX公司；豬IFN-γ檢測試劑盒(批號:200925P)和豬IL-6 ELISA檢測試劑盒(批號:200942P)，均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。具體操作方法及結(jié)果判定分別按照各試劑盒說明書進行。

1.2 試驗動物 外觀健康的60日齡商品豬500頭，每頭試驗豬做好標記。參考國家標準方法(GB/T 18935—2018、GB/T 18641—2018和GB/T 16551—2020)分別對每頭試驗豬進行豬口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)病原檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)檢測的500頭試驗豬上述3種病原均為陰性。

1.3 方法

1.3.1 疫苗混合液制備 分別取1瓶50頭份(100 mL)豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗、1瓶50頭份豬偽狂犬病活疫苗和1瓶50頭份豬瘟活疫苗，室溫回溫后，以豬口蹄疫疫苗為稀釋液，稀釋豬偽狂犬病活疫苗和豬瘟活疫苗，將稀釋好的疫苗混合液回注到豬口蹄疫疫苗瓶中，上下顛倒幾次，充分混勻后觀察是否發(fā)生分層、不溶等肉眼可見的性狀變化。

1.3.2 試驗分組及免疫 所選豬場為豬偽狂犬病陰性場，500頭商品豬隨機分為5個組，具體分組見表1，試驗前于試驗豬的前腔靜脈采血，分離血清，分別檢測豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒和豬偽狂犬病病毒抗體，結(jié)果均為陰性。

表1 分組及免疫程序

1.3.3 采血及檢測 分別于首免前、一免后4周、二免后4周，每組隨機抽取20頭試驗豬進行采血，分離血清，-20 ℃冷凍，保存?zhèn)溆谩Ｊ褂迷噭┖蟹謩e檢測FMDV-O-Ab、PRVgB-Ab和CSFV-Ab抗體水平。此外，分別于首免前、一免后14 d、二免后7 d，二免后14 d，每組隨機抽取10頭試驗豬進行采血，分離血清，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆茫褂迷噭┖蟹謩e檢測IFN-γ和IL-6細胞因子水平。

2 結(jié)果

2.1 疫苗混合液性狀觀察 使用油佐劑豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗稀釋豬偽狂犬病凍干活疫苗和豬瘟凍干活疫苗，均能很好的溶解。用油佐劑豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗做為稀釋液制備的混合疫苗，瓶底未見沉淀和不溶成分。疫苗混合液搖勻后靜置2 h，未發(fā)生分層、沉淀等肉眼可見的性狀變化。

2.2 免疫后不同時間特異性抗體檢測 疫苗免疫后，各組豬只均未出現(xiàn)嘔吐、精神沉郁、飲食減少等副反應(yīng)。液相阻斷ELISA檢測結(jié)果顯示，無論是混合免疫組還是單獨免疫組，在二免后4周的口蹄疫病毒O型抗體和A型抗體100%達到>1∶128，表明油佐劑豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗稀釋豬偽狂犬活疫苗不影響口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗的免疫效果(表2)。

表2 各組免疫前后口蹄疫病毒抗體水平

根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，各組免疫前豬偽狂犬病病毒血清抗體均為陰性。相對于陰性對照組(E組)，混合免疫組(D組)和單獨免疫組(B組)經(jīng)2次免疫后，豬偽狂犬病病毒gB抗體均極顯著上升(P<0.01)，合格率為100%。相對于單獨免疫組，混合免疫組的豬偽狂犬病病毒gB抗體提升效果極顯著(P<0.01)，表明油佐劑豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗混合豬偽狂犬病活疫苗免疫能有效提升豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果(表3)。

表3 各組免疫前后豬偽狂犬病病毒gB抗體水平

根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，各組免疫前豬瘟病毒血清抗體均為陰性。相對于陰性對照組，一免后4周，各疫苗免疫組的血清豬瘟病毒抗體水平極顯著升高(P<0.01)，二免后4周豬瘟病毒抗體仍然維持較高水平(P<0.01)。混合免疫組與豬瘟活疫苗單獨免疫組豬瘟病毒抗體水平無顯著差異(P>0.05)，表明此口蹄疫滅活疫苗混合豬瘟活疫苗不影響豬瘟活疫苗的免疫效果(表4)。

表4 各組免疫前后豬瘟病毒抗體水平

2.3 血清IFN-γ的水平檢測 為了驗證試驗豬的細胞免疫應(yīng)答，用雙抗夾心ELISA試劑盒分別測定各組豬血清IFN-γ水平。結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，一免后14 d，各疫苗免疫組的血清IFN-γ水平均極顯著升高(P<0.01)，二免后14 d仍然維持較高水平(P<0.01)，其中3種疫苗混合免疫組(D組)的血清IFN-γ水平最高(表5)。

表5 各組免疫前后血清IFN-γ水平

2.4 血清IL-6的水平檢測 為了驗證試驗豬的體液免疫應(yīng)答，用雙抗夾心ELISA試劑盒分別測定各組豬血清IL-6水平。結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，一免后14 d，各疫苗免疫組的血清IL-6水平均極顯著升高(P<0.01)，二免后14 d仍然維持較高水平(P<0.01)，其中3種疫苗混合免疫組(D組)的血清IL-6水平最高(表6)。

表6 各組免疫前后血清IL-6水平

3 討論

本研究結(jié)果表明，對商品仔豬同時免疫豬瘟活疫苗和豬偽狂犬病活疫苗均可以產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，2種疫苗在生產(chǎn)實踐中并無干擾作用。程抱林[8]和陳文武[9]均證明，將豬瘟與豬口蹄疫同步分點注射仔豬，未見疫苗間出現(xiàn)干擾。楊儒愛[10]發(fā)現(xiàn)，豬偽狂犬、豬瘟和豬口蹄疫3種疫苗同時分點注射與單獨注射相比較，仔豬應(yīng)激比例明顯上升[10]，與本試驗結(jié)果不符。分析其原因可能是不同廠家生產(chǎn)疫苗的質(zhì)量標準或原輔料(如佐劑等)存在差異[11-15]，在同時免疫時可能會相互干擾，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。本研究將3種疫苗混合后進行免疫，對單個產(chǎn)品的質(zhì)量及其原輔料統(tǒng)一性有很高的要求，可降低免疫后應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生比例。

細胞因子IFN-γ和IL-6水平是評價Th1和Th2型免疫應(yīng)答的重要指標[16-17]。IFN-γ主要由巨噬細胞、激活的NK細胞和T細胞產(chǎn)生，屬于Th1類細胞因子，主要介導細胞免疫應(yīng)答，可以促進Th0細胞分化為Th1細胞。IL-6具有多種生物學功能，屬于Th2類細胞因子，可刺激B細胞向漿細胞分化以及誘導漿細胞分泌IgG。

本研究通過抗體水平檢測和細胞因子水平檢測發(fā)現(xiàn)，3種疫苗混合免疫組與單獨免疫組相比，細胞因子IFN-γ和IL-6水平均有顯著升高。混合免疫分別與豬口蹄疫和豬瘟疫苗單獨免疫相比，豬口蹄疫病毒和豬瘟病毒抗體產(chǎn)生均無顯著差異，表明3種疫苗混合免疫，各疫苗不會產(chǎn)生干擾。3種疫苗混合免疫組的豬偽狂犬病病毒抗體有顯著的升高，原因可能是口蹄疫滅活疫苗的油佐劑成分及水包油包水(W/O/W)結(jié)構(gòu)的緩釋效果，促進了IFN-γ和IL-6等細胞因子的產(chǎn)生，促進了免疫仔豬的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，提升了豬偽狂犬病病毒抗體的水平。