臭氧化油對(duì)豚鼠感染犬小孢子菌的治療試驗(yàn)

洪慧頤，楊春燚，王維新，張 迪，林德貴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

犬貓真菌性皮膚病由皮膚癬菌侵襲毛發(fā)和皮膚角質(zhì)層引起，可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的瘙癢、皮屑、紅疹、斑塊狀脫毛等臨床癥狀，其中犬小孢子菌是小動(dòng)物臨床常見(jiàn)的皮膚癬菌[1-2]。臨床中常用的抗真菌藥主要有效成分包括特比萘芬、伊曲康唑、酮康唑等，但隨著藥物的廣泛使用，真菌的耐藥性問(wèn)題也隨之而生[2-3]。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)臭氧化油對(duì)于皮膚癬菌具有良好的抗菌、殺菌效果[4-10]，臭氧能穿透真菌的細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并破壞細(xì)胞功能，達(dá)到殺滅真菌的作用。也有研究表明，臭氧能通過(guò)抑制皮膚癬菌的產(chǎn)孢能力、增加菌絲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的漏出和降低水解酶的活性，達(dá)到抑制和殺滅真菌的效果[8-9]。而動(dòng)物機(jī)體具有良好的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對(duì)臭氧的強(qiáng)氧化性，外用醫(yī)療臭氧可在不損害機(jī)體的情況下達(dá)到殺滅真菌、促進(jìn)感染性創(chuàng)面修復(fù)的功效[11-14]。因此本試驗(yàn)選用商品化人用臭氧化油產(chǎn)品，研究其對(duì)犬小孢子菌感染的治療效果，探討臭氧療法應(yīng)用于犬貓真菌性皮膚病的醫(yī)療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)豚鼠，體重200～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016—0011。

1.2 試驗(yàn)菌種 犬小孢子菌株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床分離所得，根據(jù)患病動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、染色鏡檢、真菌培養(yǎng)以及測(cè)序結(jié)果，鑒定為犬小孢子菌。

1.3 試驗(yàn)試劑及藥品 沙氏葡萄糖瓊脂(Sabouraud dextrose agar,SDA)培養(yǎng)基(Solarbio)；RPMI-1640液體培養(yǎng)基(Gibco)；乳酸棉酚藍(lán)(安徽雷根生物技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(Solarbio)；98%伊曲康唑粉劑(上海麥克林生化科技有限公司)。快氧TM臭氧化油抗菌劑(OZONE OIL antibacterial liquid，臭氧含量為25 mg/mL)(北京偉器天成醫(yī)藥科技有限公司)；復(fù)方伊曲康唑軟膏“霉菌凈”(天津市保靈動(dòng)物保健品有限公司)。

1.4 試驗(yàn)儀器 DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SW-CJ-1B標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)(蘇州精華設(shè)備廠)；BS202光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)和電子設(shè)備有限公司)。

1.5 真菌培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)將犬小孢子菌臨床菌株接種于SDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)14 d備用。

1.6 體內(nèi)試驗(yàn)

1.6.1 菌懸液的制備 使用轉(zhuǎn)純后培養(yǎng)14 d的真菌[15]。在無(wú)菌條件下，向無(wú)菌EP管中加入1～2 mL無(wú)菌生理鹽水，用玻片或刀片將培養(yǎng)物表面的菌絲和孢子刮至微量離心管中，在振蕩器上振蕩5 min后靜置10 min，過(guò)濾沉淀菌絲后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算大分生孢子的濃度，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基將菌懸液濃度調(diào)整至104CFU/mL備用。

1.6.2 動(dòng)物模型的建立 共11只豚鼠，用電動(dòng)剃毛刀將豚鼠腰背部?jī)蓚?cè)剃毛，形成2個(gè)略大于2 cm×2 cm的脫毛區(qū)。用砂紙打磨脫毛區(qū)皮膚至滲血而不出血，形成2 cm×2 cm的滲血區(qū)。用槍頭吸取200 μL 104CFU/mL的菌懸液涂布于每一滲血區(qū)。接種后每天進(jìn)行觀察，包括豚鼠的精神、食欲、接種區(qū)域的癥狀等。

1.6.3 鑒定感染成功 接種后第3天，觀察接種部位的癥狀，采樣接種于SDA培養(yǎng)基觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行染色鏡檢，確定為犬小孢子菌感染，則為造模成功。

1.6.4 用藥治療 確定造模成功后，在接種菌懸液第14天時(shí)，將11只豚鼠兩側(cè)感染部位，即共22個(gè)感染部位隨機(jī)分為3個(gè)組，即試驗(yàn)組(n=8)、陽(yáng)性對(duì)照組(n=8)和空白對(duì)照組(n=6)。試驗(yàn)組使用快氧TM臭氧化油抗菌劑治療，陽(yáng)性對(duì)照組使用復(fù)方伊曲康唑“霉菌凈”治療，每天用藥1次，連續(xù)用藥2周，空白對(duì)照組接種成功后不做任何處理。每周觀察記錄1次，包括接種部位的癥狀、真菌培養(yǎng)檢查等。豚鼠飼養(yǎng)于同一動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼料均為同一公司提供的豚鼠專(zhuān)用糧，自由采食和飲水。

1.6.5 療效判斷標(biāo)準(zhǔn) 臨床上犬小孢子菌感染的癥狀包括發(fā)紅、丘疹、皮屑和角化等，對(duì)這4個(gè)主要癥狀用計(jì)分法分別進(jìn)行4級(jí)評(píng)價(jià)，即0=無(wú)、1=輕、2=中、3=重，相加后得到總積分。在治療前和治療2周后進(jìn)行評(píng)分。按照積分下降指數(shù)來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

癥狀積分下降指數(shù)/%=(治療前總積分-治療后總積分)/治療前總積分×100%。

療效評(píng)價(jià)分為治愈、顯效、好轉(zhuǎn)和無(wú)效共4級(jí)判定。治愈：用藥后癥狀消失，癥狀積分下降指數(shù)為100%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陰性；顯效：用藥后癥狀基本消失，癥狀積分下降指數(shù)>60%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陰性；好轉(zhuǎn)：用藥后癥狀減輕，癥狀積分下降指數(shù)30%～60%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陰性或陽(yáng)性；無(wú)效：用藥后癥狀無(wú)改善，癥狀積分下降指數(shù)<30%，采樣犬小孢子菌鏡檢、培養(yǎng)陽(yáng)性。經(jīng)療效判定后，將治愈病例、顯效病例和好轉(zhuǎn)病例計(jì)為有效病例，計(jì)算有效率。

有效率/%=(治愈病例數(shù)+顯效病例數(shù)+好轉(zhuǎn)病例數(shù))/治療總病例數(shù)×100%。

1.7 體外藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)發(fā)布的M38-A方案，選用微量液基稀釋法測(cè)定快氧TM臭氧化油抗菌劑和伊曲康唑?qū)θ℃咦泳淖钚∫志鷿舛?Minimum inhibitory concentration,MIC)，每種藥物重復(fù)測(cè)定3次。其中快氧TM臭氧化油抗菌劑的終濃度范圍為2.44～1 250 μg/mL，伊曲康唑的終濃度范圍為0.031 3～16 μg/mL。將肉眼觀察犬小孢子菌生長(zhǎng)100%受抑制作為MIC終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)試驗(yàn) 各組的癥狀積分下降指數(shù)見(jiàn)圖1，療效比較見(jiàn)表1。試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組的癥狀積分下降指數(shù)平均值分別為47.23%、72.89%、-17.93%，試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組之間均差異顯著(P<0.05)；有效率分別為87.5%、100%、0%。可見(jiàn)在療效方面，復(fù)方伊曲康唑“霉菌凈”優(yōu)于快氧TM臭氧化油抗菌劑。>

圖1 癥狀積分下降指數(shù)

表1 療效比較

在試驗(yàn)過(guò)程中，用藥開(kāi)始3～7 d，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均有部分病例出現(xiàn)發(fā)紅、瘙癢、丘疹等癥狀加重的現(xiàn)象，但用藥2周后均顯示好轉(zhuǎn)。兩組病例治療后犬小孢子菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。同時(shí)也觀察到，相較于陽(yáng)性對(duì)照組(圖2)，試驗(yàn)組部分前期癥狀較嚴(yán)重的豚鼠在治療期間有更嚴(yán)重的瘙癢、啃咬患部的現(xiàn)象，且患部顯得更為干燥(圖3)。空白對(duì)照組部分病例癥狀輕微好轉(zhuǎn)，但主要表現(xiàn)為病癥惡化(圖4)。

圖2 復(fù)方伊曲康唑“霉菌凈”治療前后對(duì)比

圖3 快氧TM臭氧化油抗菌劑治療前后對(duì)比

圖4 空白對(duì)照組

2.2 體外藥敏試驗(yàn) 體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，快氧TM臭氧化油抗菌劑對(duì)犬小孢子菌的MIC范圍為312.5～625.0 μg/mL，高于伊曲康唑的MIC范圍(0.5～2.0 μg/mL)。

表2 受試藥物對(duì)犬小孢子菌的最小抑菌濃度

3 討論

3.1 藥物不良反應(yīng) 魯建云等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在多次給藥試驗(yàn)和過(guò)敏試驗(yàn)中，基質(zhì)油(茶油)和臭氧化油均對(duì)豚鼠的皮膚具有輕微刺激性且對(duì)個(gè)別豚鼠輕度致敏，因此筆者認(rèn)為在臨床應(yīng)用時(shí)控制臭氧化油的使用濃度和使用頻率，能有效避免其對(duì)皮膚的刺激性和過(guò)敏性，達(dá)到良好的治療效果。快氧TM臭氧化油抗菌劑是已應(yīng)用于治療人類(lèi)感染性疾病的產(chǎn)品，有明顯療效且并未產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)，考慮到豚鼠、犬貓皮膚與人類(lèi)皮膚的結(jié)構(gòu)存在差異性，可能是由于本藥物臭氧濃度過(guò)高導(dǎo)致初始癥狀較嚴(yán)重的豚鼠出現(xiàn)更明顯瘙癢、啃咬患部、治療周期較長(zhǎng)的現(xiàn)象。

3.2 本試驗(yàn)的合理性分析 體內(nèi)試驗(yàn)部分未設(shè)置陰性對(duì)照組，即用基質(zhì)油(茶油)治療，以觀察基質(zhì)油在治療過(guò)程中是否有所作用。有研究表明，茶油具有促進(jìn)藥物經(jīng)皮吸收的作用，能在一定程度上緩解人類(lèi)皮膚病癥狀[16]。Varol等選用橄欖油、氟康唑和臭氧化油進(jìn)行對(duì)比治療試驗(yàn)，結(jié)果顯示，橄欖油雖然有一定的抑菌效果，但效果遠(yuǎn)不及臭氧化油[10]。故猜想本試驗(yàn)中若設(shè)置茶油作為陰性對(duì)照組，其結(jié)果可能是茶油對(duì)犬小孢子菌感染有輕微治療效果，相較于空白對(duì)照組更好，但效果仍低于試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組。茶油主要還是作為臭氧化油的溶劑和透皮劑存在。

體外藥敏試驗(yàn)部分，由于目前還沒(méi)有臭氧化油對(duì)犬小孢子菌的MIC測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)參考了Thomson等[7]和Geweely[9]的研究，采用微量液基稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在試驗(yàn)中觀察到快氧TM臭氧化油抗菌劑與液體培養(yǎng)基分離的現(xiàn)象，這可能與該產(chǎn)品本身的特性有關(guān)；且由于臭氧具有不穩(wěn)定性，可能在操作過(guò)程中分解而無(wú)法維持抑菌效果。因此猜想本藥敏試驗(yàn)中，臭氧化油的抑菌作用可能是由于油劑覆蓋于液體表面創(chuàng)造了無(wú)氧環(huán)境，從而抑制真菌生長(zhǎng)而得。故認(rèn)為此方法所測(cè)定的臭氧化油MIC僅具有試驗(yàn)參考意義。

對(duì)于未有明確測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的藥物與菌株，或者體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果不能反映體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的情況，李杰[15]認(rèn)為可以通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法比較不同藥物的抑菌效果，能更為直觀地顯示藥物的抑菌能力與藥物間的差異，且結(jié)果與臨床更為貼切。所以后期再進(jìn)行臭氧化油抗菌劑的體外藥敏試驗(yàn)可考慮采用瓊脂擴(kuò)散法。Geweely[9]用瓊脂稀釋法測(cè)得臭氧化橄欖油(Oleozone)對(duì)多種皮膚癬菌的MIC范圍為0.53～2.00 mg/mL，其中犬小孢子菌最敏感。

3.3 臭氧化油對(duì)真菌性皮膚病的治療作用 不同研究表明，臭氧化油用于治療兔子感染犬小孢子菌[5]、紅色毛癬菌和白色念珠菌導(dǎo)致的灰指甲病例[4]、小鼠感染犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌時(shí)[7]，均表現(xiàn)出抗真菌活性，可作為治療臨床皮膚癬菌感染的安全替代品。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組用藥后臨床癥狀有所好轉(zhuǎn)，真菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，即快氧臭氧化油抗菌劑能夠有效抑菌。對(duì)于感染犬小孢子菌的犬貓，癥狀較輕者可以考慮使用快氧臭氧化油抗菌劑治療；較嚴(yán)重的病例，宜先試用、觀察其是否存在不良反應(yīng)，或者調(diào)整臭氧化油的濃度后再投入使用。

此外，Varol等[10]研究指出臭氧化油的抗菌活性與其過(guò)氧化值(Peroxide value, PV)有關(guān)，而臭氧化的時(shí)間和酸堿度均能影響過(guò)氧化值。有研究表明，油劑的過(guò)氧化值越高，其抗菌、殺菌活性越好[6,10,17]。結(jié)合本試驗(yàn)體外部分結(jié)果，筆者認(rèn)為通過(guò)調(diào)整生產(chǎn)方式、油劑、臭氧含量、使用頻率、酸堿度和過(guò)氧化值等，臭氧化油有望成為一種新型的抗菌藥物應(yīng)用于犬貓真菌性皮膚病的治療。后期的試驗(yàn)可評(píng)估不同濃度或酸堿度的臭氧化油對(duì)皮膚癬菌感染病例的治療效果，以開(kāi)發(fā)適合犬貓使用的臭氧化油抗菌劑。