丹皮酚對急性胰腺炎小鼠的保護效果

尹 星，范露露，金圣奇，姜凱騰，范嘉杰，張 鵬

(沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122)

胰腺周圍脂肪組織和腺泡壞死被認為是急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)的主要病理特征[1]。近年來臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，AP發(fā)病率居高不下，然而，經(jīng)過大量的試驗和臨床研究，仍未發(fā)現(xiàn)一種治療該病的特效藥物。因此，AP靶向藥物的研發(fā)一直備受醫(yī)藥界關(guān)注。丹皮酚是從牡丹根皮中分離得到的主要成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等作用[2]，臨床上多用于治療結(jié)腸炎、缺血再灌注損傷、牙周炎等。AP會引起胰腺腺泡細胞內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)升高，導(dǎo)致血清鈣離子含量逐漸下降[3]，同時大量腺泡細胞破壞，阻塞胰管，使其內(nèi)的各種消化酶無法進入十二指腸，從而反流入血，使得血清中脂肪酶和淀粉酶的含量顯著增多[4]。故本試驗采用L-精氨酸誘導(dǎo)AP小鼠模型，通過檢測血清中淀粉酶和鈣離子含量以及血漿中各炎癥指標(biāo)來評價丹皮酚對AP小鼠的保護作用，以期為相關(guān)獸藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明系雄性SPF級小鼠50只，體重18～22 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2020—0001。

1.2 主要試劑 丹皮酚和L-精氨酸，均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；血清淀粉酶檢測試劑盒(C016-1-1)和鈣離子檢測試劑盒(C004-1-1)，均購自南京建成生物科技有限公司；蘇木精-伊紅(H.E.)染液,購自塞維爾生物技術(shù)有限公司；其他試劑，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗分組與設(shè)計 將小鼠隨機分成5個組，即空白對照組、模型組和不同劑量丹皮酚組。不同劑量丹皮酚組每組灌胃劑量分別為25、50 mg/(kg·bw)和100 mg/(kg·bw)，灌胃量均為0.5 mL，同時空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d。在最后1次灌胃給藥1 h后，采用20 %L-精氨酸腹腔注射模型組和不同劑量丹皮酚組小鼠，給藥劑量為4 g/(kg·bw)，6 h后進行眼球采血，隨機取各組6只小鼠的血漿，一部分用于血常規(guī)檢測；另一部分低溫離心10 min分離血清，用于血清淀粉酶和鈣離子含量的測定；隨機取各組4只小鼠的胰腺，用于病理切片及蘇木精-伊紅(H.E.)染色。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 胰腺組織病理切片及H.E.染色 取各組小鼠的胰腺組織浸入到10%甲醛溶液中固定48 h，通過石蠟切片制作、H.E.染色和脫水封片后在顯微鏡下觀察各組胰腺組織的病理學(xué)特點，進行圖片采集分析。

1.4.2 胰腺病理組織評分 在Schmidt評分標(biāo)準(zhǔn)[5]的基礎(chǔ)上進行改良，并參照Pozsar等[6]的方法對胰腺水腫、炎癥、出血和壞死進行計分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1，每張切片隨機計數(shù)4個視野，取平均分代表其損傷程度。

表1 胰腺組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 血清淀粉酶活性測定 采取淀粉-碘比色法測定各組小鼠血清中淀粉酶活性，按照血清淀粉酶試劑盒說明書進行測定。

1.4.4 鈣離子含量測定 采取甲基百里香酚藍比色法測定各組小鼠血清鈣離子的含量，按照鈣離子試劑盒說明書進行測定。

1.4.5 血常規(guī)檢測 使用愛德士干式血細胞分析儀(VetAutoread)檢測血常規(guī)指標(biāo)：白細胞數(shù)量、顆粒性白細胞數(shù)量、纖維蛋白原含量。

1.5 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有數(shù)據(jù)需要進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行一維方差分析，經(jīng)過分析之后的各組試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均列入表格中。

2 結(jié)果

2.1 小鼠狀態(tài)檢查 給予20%L-精氨酸后對各組小鼠進行觀察，空白對照組小鼠無異常表現(xiàn)。模型組小鼠在給藥10 min后出現(xiàn)精神沉郁、步態(tài)不穩(wěn)、不喜運動等臨床表現(xiàn)，個別小鼠還有呼吸加深、加快等現(xiàn)象。不同劑量丹皮酚組小鼠均出現(xiàn)不同程度精神恍惚、不喜運動現(xiàn)象。其中25 mg/(kg·bw)組和50 mg/(kg·bw)組小鼠在給藥2 h后出現(xiàn)聚集成堆、食欲減退現(xiàn)象；100 mg/(kg·bw)組小鼠在給藥4 h后精神狀態(tài)輕度沉郁、群聚。

2.2 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果如圖1所示，空白對照組小鼠的胰腺組織形態(tài)正常，未見病理學(xué)變化(圖1A)；模型組小鼠胰腺組織出現(xiàn)崩解，腺泡細胞空泡化，局部有充血并伴有淋巴細胞、單核細胞浸潤(圖1B箭頭)；不同劑量丹皮酚組小鼠胰腺組織腺泡呈不同程度空泡化及單核細胞浸潤，其中25 mg/(kg·bw)組較為嚴重；25 mg/(kg·bw)組和50 mg/(kg·bw)組小鼠胰腺組織可見充血、腺泡細胞崩解和組織間隙增大(圖1C、1D)；100 mg/(kg·bw)組胰腺病理變化較模型組明顯改善(圖1E)。

圖1 小鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 (H.E.染色，400×)

2.3 胰腺病理組織評分 結(jié)果如表2所示，空白對照組與模型組小鼠胰腺組織病理學(xué)評分差異極顯著(P<0.01)，結(jié)合圖1說明小鼠AP模型構(gòu)建成功。不同劑量丹皮酚組小鼠胰腺組織病理學(xué)評分之間有一定的量效關(guān)系，即隨丹皮酚劑量的加大胰腺組織病理學(xué)評分逐漸降低，且50 mg/(kg·bw)組和100 mg/(kg·bw)組與模型組相比，具有極顯著性差異(P<0.01)，說明丹皮酚對AP小鼠有一定的保護效果。

2.4 丹皮酚對AP小鼠血清淀粉酶活性的影響 結(jié)果如表2所示，模型組血清淀粉酶活性較空白對照組極顯著升高(P<0.01)，說明小鼠AP模型構(gòu)建成功。不同劑量丹皮酚組血清淀粉酶活性較模型組均極顯著降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性，即隨劑量的加大血清淀粉酶活性逐漸降低，說明不同劑量丹皮酚能夠極顯著地降低AP小鼠血清淀粉酶含量。

2.5 丹皮酚對AP小鼠血清鈣離子含量的影響 結(jié)果如表2所示，模型組血清鈣離子含量較空白對照組極顯著降低(P<0.01)，說明小鼠AP模型構(gòu)建成功。不同劑量丹皮酚組血清鈣離子含量較模型組均極顯著升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性，即隨丹皮酚劑量的加大血清鈣離子含量逐漸升高，說明不同劑量丹皮酚能夠極顯著地恢復(fù)AP小鼠血清鈣離子含量。

表2 丹皮酚對AP小鼠病理損傷及生化指標(biāo)的影響

2.6 丹皮酚對AP小鼠血漿中炎癥指標(biāo)的影響 結(jié)果如表3所示，模型組小鼠血漿中白細胞數(shù)量、顆粒性白細胞數(shù)量、纖維蛋白原含量較空白對照組均極顯著上調(diào)(P<0.01)，說明模型組小鼠發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，符合AP模型臨床癥狀。不同劑量丹皮酚組白細胞數(shù)量、顆粒性白細胞數(shù)量、纖維蛋白原含量與模型組相比均極顯著下調(diào)(P<0.01)，且呈劑量依賴性，即隨丹皮酚劑量的加大各炎癥指標(biāo)呈不同程度降低，說明不同劑量丹皮酚能夠極顯著地降低AP小鼠各種炎癥指標(biāo)。

表3 丹皮酚對AP小鼠血漿中炎癥指標(biāo)的影響

3 討論

AP是一種常見的炎癥性疾病，臨床上對其發(fā)病原因及發(fā)病機制尚不明確，且有效治療AP的藥物屈指可數(shù)。盡管研究發(fā)現(xiàn)抗分泌藥物、抗氧化劑、蛋白酶抑制劑、血小板活化因子抑制劑和抗炎免疫調(diào)節(jié)劑可以緩解AP的嚴重程度，但這些藥物在臨床應(yīng)用仍有局限性[7]。因此，許多學(xué)者將治療AP藥物的研究指向傳統(tǒng)中藥，希望從中尋求一味替代性藥物。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎作用。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚通過抑制小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，緩解急性肺炎的臨床癥狀。此外用丹皮酚灌腸給藥也可以有效治療三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[9]。因此本試驗利用小鼠AP模型考察丹皮酚的抗炎效果，為臨床抗炎藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

血清淀粉酶和鈣離子是臨床診斷胰腺炎的重要指標(biāo)，本試驗通過考察丹皮酚對AP小鼠保護效果時發(fā)現(xiàn)，不同劑量丹皮酚均能顯著降低AP小鼠淀粉酶含量并糾正低血鈣水平。此外，也有學(xué)者證明，槲皮素[10]、丹參[11]、大黃素[12]和黃芩素[13]等中藥單體也具有相似的效果。近年來有學(xué)者證明，丹皮酚注射液對AP大鼠模型也有一定的保護作用，且不同劑量組對大鼠胰腺組織病理學(xué)評分之間有一定的量效關(guān)系，即隨丹皮酚劑量的加大胰腺組織病理學(xué)評分逐漸降低，同時緩解了大鼠胰腺的病變程度[14]，與本試驗結(jié)果一致。纖維蛋白原是由肝細胞合成和分泌的一種糖蛋白，在血漿中主要參與凝血和止血過程，是反映機體炎癥反應(yīng)中最敏感的蛋白指標(biāo)[15]，因此，本試驗引入纖維蛋白原作為檢測AP嚴重程度的重要指標(biāo)，以期為預(yù)防和治療AP提供新思路。

綜上所述，本試驗表明丹皮酚對AP小鼠具有顯著的保護效果。本試驗結(jié)論為后期臨床預(yù)防和治療動物AP提供替代性藥物選擇，同時也為促進動物福利與社會和諧健康發(fā)展帶來巨大的社會與經(jīng)濟價值。