雞源沙門菌的分離鑒定、血清分型和耐藥性分析

姬書會，郭世棟，蘇玉賢

(1.平頂山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河南 平頂山 467000 ； 2.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ，河南 新鄉(xiāng) 453000 ； 3.平頂山市畜牧技術(shù)推廣站，河南 平頂山 467000)

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科的重要致病菌屬，在人和動(dòng)物的腸道細(xì)胞內(nèi)寄生，可引起動(dòng)物腹瀉、人腸胃炎和食物中毒。沙門菌血清型繁多，國內(nèi)報(bào)道的有290多種[1]。絕大部分血清型對人類和畜禽有致病性，是一種重要的人獸共患病病原菌和食源性致病菌[2]。

雞源沙門菌病是某些致病性沙門菌引起的雞白痢病、雞副傷寒病和雞傷寒病的統(tǒng)稱，通常造成雛雞腹瀉、脫水，甚至死亡，成年雞呈慢性或隱性感染，長期攜帶病原菌，蛋雞產(chǎn)蛋性能下降。病雞和帶菌雞為主要傳染源，可以水平和垂直傳播，養(yǎng)雞場如果發(fā)生疫情很難完全凈化，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展，同時(shí)也直接威脅公共衛(wèi)生安全。

目前，養(yǎng)雞場在加強(qiáng)生物安全、疫苗免疫防控的同時(shí)，使用抗生素成為預(yù)防和治療該病的臨床用藥主要手段。但是，由于抗生素的長期大量使用和不合理用藥，導(dǎo)致沙門菌株耐藥性越來越強(qiáng)，尤其是多重耐藥現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，動(dòng)物成為耐藥菌的重要儲存庫[3]，給有效防治沙門菌病帶來很大困難。由于沙門菌血清型眾多，不同地區(qū)或者同一地區(qū)內(nèi)的流行菌株也存在差異[4]，因此，了解當(dāng)?shù)仉u源沙門菌流行特點(diǎn)和耐藥性情況，對于有效防控雞沙門菌病具有重要指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)于2020年采集河南省平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)雞源病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、血清型分析和耐藥性檢測，為今后雞源沙門菌病凈化、篩選臨床安全合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源和菌株 無菌采集河南省平頂山、新鄉(xiāng)35個(gè)規(guī)模化蛋雞、肉雞場的疑似患沙門菌病的雞的雞蛋、肝臟、脾臟、肛拭子和腸道等器官組織樣品154份。大腸埃希菌(ATCC29922)和腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC3377)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、SS瓊脂培養(yǎng)基、沙門菌屬顯色培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、沙門菌屬血清診斷試劑盒(60種)，均購自蘭州生物制品有限公司；DL2 000 DNA Marker、2×PCR Premix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；15種K-B藥敏紙片，包括大觀霉素(SPT)、氨芐西林(AMP)、環(huán)丙沙星(CIP)、呋喃唑酮(FUR)、阿米卡星(AN)、氟苯尼考(FLO)、鏈霉素(STR)、復(fù)方新諾明(SXT)、新霉素(NTL)、阿奇霉素(AZM)、多西環(huán)素(DOX)、左氧氟沙星(LEV)、慶大霉素(CN)、頭孢曲松(CTRX)、頭孢喹肟(CTX)，均購自杭州天河微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.4—2016)進(jìn)行沙門菌的分離培養(yǎng)。每份稱取25 g樣品放入含225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋，10 000 r/min離心1～2 min,(36±1)℃培養(yǎng)8～18 h。取上述樣品混合物1 mL接種于10 mL TTB增菌液，(42±1)℃培養(yǎng)18～24 h，同時(shí)，另取上述樣品混合物1 mL接種于10 mL SC增菌液，(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。然后，用接種環(huán)挑取增菌液分別接種于沙門菌屬顯色培養(yǎng)基和SS瓊脂平板，(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h。觀察每個(gè)平板上的菌落特征。挑取沙門菌屬顯色培養(yǎng)基上紫色菌落和SS平板上的無色透明或黃色、有黑點(diǎn)的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)和細(xì)菌涂片，革蘭染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.4 生化鑒定 用生理鹽水將疑似菌落制備成滴度適當(dāng)?shù)木鷳乙海瑹o菌接種于靛基質(zhì)(Indole)、pH 7.2尿素(URE)、硫化氫(H2S)、氰化鉀(KCN)、蔗糖(SAC)、葡萄糖(GLU)、甘露醇(MAN)、山梨醇(AG)、賴氨酸(Lys)和V-P試驗(yàn)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄結(jié)果。結(jié)果判定依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.4—2016)進(jìn)行。

1.5 PCR鑒定 挑取待檢菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)6 h，備檢待用。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取疑似沙門菌和對照菌株基因組DNA，并設(shè)大腸埃希菌(ATCC29922)為陰性對照和腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC3377)為陽性對照。根據(jù)GenBank(登錄號：JQ665438.1)發(fā)表的序列，針對沙門菌fimY基因設(shè)計(jì)1對引物，上游引物序列：5′-CGCCCAGCCATACGGATAACC-3′,下游引物序列：5′-TACCACGCAGGAAAGACACC-3′。引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小427 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR Premix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄。

1.6 血清型鑒定 分離菌株的血清型分群和定型鑒定根據(jù)GB 4789.4—2016標(biāo)準(zhǔn)采用玻片凝集試驗(yàn)方法。待檢菌以1.2% LB瓊脂作為測定A～F、O、H抗原的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，用生理鹽水制備成2麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙骸Ｈ?0 μL血清診斷試劑盒中的血清于潔凈玻片上，再挑取20 μL菌懸液與血清搖動(dòng)混勻30 s，觀察凝集結(jié)果。同時(shí)，設(shè)生理鹽水為陰性對照試驗(yàn)，觀察菌株是否發(fā)生自凝現(xiàn)象。1 min 內(nèi)凝集者判為陽性，均勻渾濁或清亮者為陰性。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原鑒定結(jié)果，查閱沙門菌抗原表，進(jìn)行被檢菌株血清型分群和定型。

1.7 藥敏試驗(yàn) 藥敏質(zhì)控菌株為腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3377。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法(Kirby-Baue)測定48株分離菌對15種常見抗菌藥的耐藥性，測量抑菌圈直徑大小，依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定15種抗菌藥的敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)結(jié)果，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判定耐藥表型。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) (36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h后，沙門菌屬顯色培養(yǎng)基的菌落呈現(xiàn)為大小一致、邊緣整齊的紫色菌落，SS瓊脂平板上菌落呈現(xiàn)圓形、黑色金屬光澤，有些為中間黑色菌落，周圍培養(yǎng)基沒有變化。革蘭染色為陰性，鏡檢可見短桿狀菌，兩端鈍圓，單個(gè)、成對或成叢存在。共有48株初步判定為疑似沙門菌菌株。

2.2 生化鑒定 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，48株分離菌株均能分解甘露醇、葡萄糖和山梨醇，不發(fā)酵蔗糖，賴氨酸、硫化氫試驗(yàn)陽性，靛基質(zhì)、尿素、V-P試驗(yàn)陰性，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.4—2016)符合典型的沙門菌特征。

2.3 PCR鑒定 部分分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果見圖1。凝膠電泳結(jié)果顯示，以沙門菌fimY基因引物對48株分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，均能擴(kuò)增出大小約為427 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致，陰性對照無條帶。對來自平頂山、新鄉(xiāng)不同縣市的樣品和鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)，48株沙門菌中平頂山有29株(郟縣13株、葉縣9株、舞鋼7株)，新鄉(xiāng)有19株(延津11株、原陽8株)。結(jié)合生化鑒定結(jié)果，本次沙門菌檢出率為31.17%，表明平頂山和新鄉(xiāng)均有不同程度雞源沙門菌感染。

圖1 部分沙門菌分離菌株的PCR鑒定

2.4 血清型鑒定 采用玻片凝集法對48株沙門菌進(jìn)行血清型分型試驗(yàn)，結(jié)果顯示，共鑒定出44株沙門菌的血清型，占沙門菌分離株的91.67%(44/48)，分屬3個(gè)大群5種血清型，包括19株雞白痢沙門菌(39.58%)、13株腸炎沙門菌(27.08%)、7株鼠傷寒沙門菌(14.58%)、3株甲型副傷寒沙門菌(6.25%)和2株乙型副傷寒沙門菌(4.17%)，其余4株未確定出血清型。優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌。平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)血清型分布見表1。

表1 平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)雞源沙門菌血清型分布

2.5 藥敏試驗(yàn) 對48株雞源沙門菌進(jìn)行15種抗菌藥耐藥性檢測，結(jié)果見表2、表3。分離菌株對氨芐西林耐藥率最高，為95.83%，其次，對呋喃唑酮(66.67%)、大觀霉素(64.58%)、鏈霉素(62.50%)也具有較高的耐藥性；對氟苯尼考(22.92%)、環(huán)丙沙星(12.50%)、復(fù)方新諾明(12.50%)、左氧氟沙星(10.42%)耐藥率相對較低；對頭孢喹肟(8.33%)、頭孢曲松(8.33%)、慶大霉素(6.25%)、阿米卡星(6.25%)、多西環(huán)素(4.17%)、阿奇霉素(4.17%)和新霉素(2.08%)比較敏感，耐藥率均低于10.00%。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)

表3 48株沙門菌分離株血清型抗菌藥耐藥譜

在48株雞源沙門菌分離株中，有 2 株(4.17%)不耐藥，對所有試驗(yàn)藥物均表現(xiàn)敏感，9株對2種抗菌藥耐藥，其余37 株則表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象(耐 3 種及 3 種以上抗菌藥)，多重耐藥率為77.08%。耐藥模式較多，以4重耐藥最多，有15 株，占31.25%(15/48)；最多耐受8種抗菌藥物，有1株，占2.08%(1/48)。

3 討論

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定和PCR方法對來自平頂山、新鄉(xiāng)的154份雞源樣品進(jìn)行分離鑒定，共分離鑒定出雞源沙門菌48株，檢出率為31.17%，明顯高于錢明珠等[5]對河南省部分雞沙門菌流行病調(diào)查報(bào)道的分離率(27.97%)和楊瑞等[1]在2019—2020 年對河北地區(qū)雞源沙門菌流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道的分離率(25.51%)。本次調(diào)查結(jié)果表明，被調(diào)查養(yǎng)雞場雞源沙門菌分布較廣，污染較重，建議引起重視，加強(qiáng)疫病防控，減少污染面。

本試驗(yàn)血清學(xué)分型結(jié)果顯示，共鑒定出5種血清型，其優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌(39.58%)和腸炎沙門菌(27.08%)。多地學(xué)者研究結(jié)果顯示[6-8]，這2種血清型感染宿主范圍廣，是我國養(yǎng)雞場常見的流行菌株。作為腸桿菌科沙門菌屬成員的雞白痢沙門菌是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的常見致病菌，可以引起雞敗血癥、雞白痢病。腸炎沙門菌是造成動(dòng)物感染沙門菌和引起人類食物細(xì)菌性中毒的重要病原菌之一。此外，本試驗(yàn)還檢出鼠傷寒沙門菌(14.58%)、甲型副傷寒沙門菌(6.25%)和乙型副傷寒沙門菌(4.17%)。表明上述血清型不同程度存在于兩地區(qū)雞群和飼養(yǎng)環(huán)境中，因此，需要以本地流行血清型為重點(diǎn)加強(qiáng)監(jiān)測。

本試驗(yàn)對48株分離菌進(jìn)行了15種抗菌藥耐藥性檢測，結(jié)果顯示，分離菌對氨芐西林、呋喃唑酮、大觀霉素和鏈霉素具有較高的耐藥性，耐藥率高于60.00%，與宋艷等[9]報(bào)道基本一致，這與當(dāng)?shù)仞B(yǎng)雞場長期不規(guī)范使用抗菌藥有關(guān)，導(dǎo)致雞沙門菌耐藥性增強(qiáng)；盡管分離菌對頭孢喹肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、多西環(huán)素、阿奇霉素和新霉素比較敏感，但是部分抗菌藥的中敏率偏高，比如新霉素、頭孢喹肟、頭孢曲松的中敏率分別為60.42%、43.75%和41.67%，說明這些藥物在臨床一線用藥中也存在不合理使用現(xiàn)象，應(yīng)引起關(guān)注和跟蹤監(jiān)測。本試驗(yàn)中48株雞源沙門菌多重耐藥率為77.08%，多重耐藥譜較廣，以4重耐藥最多，最多耐受8種抗菌藥物，耐藥譜型較多。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，平頂山和新鄉(xiāng)地區(qū)雞源沙門菌耐藥性比較嚴(yán)重，耐藥表型多樣化，提示在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)臨床治療和預(yù)防過程中應(yīng)科學(xué)合理使用抗菌藥，強(qiáng)化流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性監(jiān)測，聯(lián)合用藥，輪換用藥，使用抗菌藥替代品，避免耐藥性進(jìn)一步嚴(yán)重。