湖南省長沙市野豬源蛔蟲分子鑒定

薛 爽，龔騰芳，賀峻琳，陳叔玉，劉 偉

(1. 長沙市動植物疫病預防控制中心，湖南 長沙 410000 ； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128)

蛔蟲隸屬于線蟲綱，蛔目，蛔科，是一種常見的腸道寄生線蟲[1]。豬感染蛔蟲后可引起消瘦、貧血、腹瀉、精神沉郁、生長不良等癥狀，嚴重時可阻塞腸道引起仔豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[2-3]。

僅通過形態(tài)難以區(qū)分豬蛔蟲和人蛔蟲。研究表明，人蛔蟲可感染豬，豬蛔蟲也可感染人，并且有報道表明人蛔蟲和豬蛔蟲之間可以雜交，長期以來這2個物種是否為同一物種一直存在爭議[4-6]。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，分子診斷技術(shù)可以彌補形態(tài)學鑒定的不足和缺點，更適合相似物種的精確鑒定。近年來，越來越多的學者使用全基因組或單個保守基因序列研究蛔蟲的種系遺傳結(jié)構(gòu)。Betson等利用線粒體cox1基因和一組微衛(wèi)星標記對來自歐洲、非洲、亞洲和拉丁美洲的410條蛔蟲樣品進行了基因分型，發(fā)現(xiàn)不同國家、村莊和宿主的寄生蟲種群之間存在顯著的遺傳分化[7]。Zhou等選用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和多個微衛(wèi)星標記首次表明了人型蛔蟲和豬型蛔蟲雜交體可以感染豬和人類[8]。

野豬作為我國的保護動物，是生態(tài)鏈中重要的一環(huán)。蛔蟲寄生會影響野豬生長發(fā)育甚至造成野豬死亡，同時隨著野豬的活動可將蛔蟲卵排入環(huán)境中，導致其他動物甚至人的感染，造成嚴重危害[9-10]。為了探究野豬體內(nèi)蛔蟲與其他蛔蟲的種群遺傳關(guān)系，本試驗對湖南省長沙市瀏陽野豬腸道內(nèi)蛔蟲的線粒體部分cox1基因(pcox1)、部分nad5基因(pnad5)和ITS基因進行PCR擴增和測序，對序列進行分析以確定野豬源蛔蟲與其他蛔蟲的物種關(guān)系，為野豬源蛔蟲防控研究提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣本 本試驗的樣品分別采自湖南省長沙市瀏陽市某養(yǎng)殖場病死的2頭野豬，其中4條雄蛔蟲和5條雌蛔蟲，分別編號為CS1～CS4(雄蛔蟲)和CS5～CS9(雌蛔蟲)，參照資料對其進行形態(tài)學鑒定后，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶和PCR試劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白酶K，購自Merck公司；3對引物由北京擎科生物有限公司合成。

1.3 PCR擴增 參照參考文獻[11-13]設(shè)計合成3對引物，見表1。3個基因的擴增體系均為25 μL:TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s(pcox1、pnad5)或40 s(ITS)；50 ℃(pcox1、ITS)或55 ℃(pnad5)退火30 s；72 ℃延伸30 s(pcox1)、1 min(pnad5)、5 min(ITS)，共38個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min(pcox1、pnad5)或10 min(ITS)。

表1 3段基因擴增的引物

1.4 基因測序及分析 PCR陽性產(chǎn)物由北京擎科有限公司雙向測序。用DNAMAN 7.0對獲得的pcox1、pnad5和ITS基因序列進行對比，剔除和對齊，并與GenBank收錄的人蛔蟲(Ascarislumbricoides)和豬蛔蟲(Ascarissuum)的pcox1、pnad5和ITS基因進行對比。用DNASTAR 5.0軟件進行基因同源性分析；利用DnaSP 5.0軟件計算基因多樣性；以獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)為外群，選用Kimura-2-parameter模型，用MEGA 7.0構(gòu)建種系發(fā)育進化樹(Bootstrap test=1 000)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 野豬源蛔蟲分離株擴增的pcox1、pnad5和ITS基因片段如圖1～3所示，大小分別約為400 、480 bp和900 bp，未見非特異性條帶，空白對照為陰性。

圖1 野豬源蛔蟲線粒體pcox1 PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

2.2 基因的多樣性分析 經(jīng)過對比校正后，9株野豬源蛔蟲分離株pcox1、pnad5和ITS基因片段大小分別為391、491 bp和867 bp;pcox1基因的A+T堿基含量為66.70%～67.00%，C+G堿基含量為33.00%～33.20%；pnad5基因的A+T堿基含量為70.50%～71.10%，C+G堿基含量為28.90%～29.30%；ITS基因的A+T堿基含量為58.90%～60.00%，C+G堿基含量為40.00%～40.10%。

圖2 野豬源蛔蟲線粒體pnad 5 PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

圖3 野豬源蛔蟲核糖體ITS PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

9株野豬樣品分離株的pcox1堿基差異率為0.00%～0.30%、pnad5為0.00%～0.60%、ITS為0.00%～0.04%。9株野豬樣品分離株線粒體pcox1基因僅有1個堿基變異位點(位于343 bp處，共391 bp)，為嘧啶之間的堿基替換，只有2種單倍型；9株野豬樣品分離株線粒體pnad5基因有5個堿基變異位點，主要為嘌呤之間的堿基替換，共有6種單倍型；9株野豬樣品分離株核糖體ITS基因僅有1個堿基變異位點(位于117 bp處，共867 bp)，為嘧啶之間的堿基替換，只有2種單倍型，見表2。9株野豬樣品分離株擴增序列與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的人蛔蟲線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因序列堿基差異率分別為0.00%～0.30%、1.00%～1.60%和0.00%～0.07%，與豬蛔蟲分離株相應序列堿基差異率分別為0.30%～1.80%(pcox1)、1.00%～7.20%(pnad5)和0.70%～1.30% (ITS)。

表2 pcox1、pnad 5和ITS基因序列核苷酸多態(tài)性

2.3 種系發(fā)育分析 基于pcox1、pnad5和ITS基因分別構(gòu)建野豬源蛔蟲系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4～6所示，野豬源蛔蟲和人蛔蟲分離株均聚合在同一分支上，與豬蛔蟲分離株相隔較近，與獅弓蛔蟲相隔較遠。

圖4 野豬源蛔蟲pcox1基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 野豬源蛔蟲pnad 5基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 野豬源蛔蟲ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

野豬源蛔蟲的有效鑒定是對野豬蛔蟲病進行預防的前提，但傳統(tǒng)的形態(tài)學方法難以對形態(tài)相似的蟲株進行準確的鑒定。線粒體基因由于相對保守、母系遺傳等優(yōu)點現(xiàn)已成為寄生蟲分類與鑒定的有力工具[14-15]。本試驗擴增的9株野豬源蛔蟲線粒體pcox1和ITS基因片段堿基差異率分別為0.00%～0.30%和0.00%～0.04%，其差異主要為堿基互換，表明野豬源蛔蟲pcox1和ITS基因種內(nèi)高度保守， pnad5基因片段堿基差異率為0.00%～0.60%，種內(nèi)相對保守；與人蛔蟲分離株pcox1、pnad5和ITS基因序列堿基差異率分別為0.00%～0.30%、1.00%～1.60%和0.00%～0.07%，和豬蛔蟲對應的基因序列堿基變異率分別為0.30%～1.80% (pcox1)、1.00%～7.20%(pnad5)和 0.70%～1.30%(ITS)。可見野豬源蛔蟲pcox1、pnad5和ITS基因種內(nèi)變異較小，與人蛔蟲和豬蛔蟲堿基差異率均較小，但與人蛔蟲堿基差異率更小。此外，本試驗中9株野豬源蛔蟲分離株pcox1、pnad5和ITS基因序列核苷酸多樣性均低于0.01，結(jié)果表明野豬源蛔蟲pcox1、pnad5和ITS基因遺傳變異程度低。

基于野豬源蛔蟲pcox1、pnad5和ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，本試驗分離的9株野豬源蛔蟲樣品均與人蛔蟲聚合為同一分支，然后與豬蛔蟲聚合為一大支，與獅弓蛔蟲相隔較遠。目前國內(nèi)僅存在通過形態(tài)學鑒定的野豬感染蛔蟲的案例報道，且均鑒定為豬蛔蟲[2-3]。本試驗首次通過線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因?qū)σ柏i源蛔蟲進行鑒定和遺傳變異分析。基于線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因分析結(jié)果表明野豬源蛔蟲和人蛔蟲、豬蛔蟲同源性均很高。

人蛔蟲和豬蛔蟲的分類地位一直存在爭議，研究者試圖從多方面來進行比較，但結(jié)果不盡相同[16-17]。鄒勇[13]分別對豬蛔蟲和人蛔蟲的線粒體pcox1和ITS基因序列進行比較，發(fā)現(xiàn)人蛔蟲和豬蛔蟲pcox1和ITS基因差異較小。吳昌義等[12]發(fā)現(xiàn)，豬蛔蟲和人蛔蟲線粒體pnad5基因差異較小。Easton等[4]報道，豬蛔蟲和人蛔蟲存在雜交復合體感染人類，使豬蛔蟲和人蛔蟲分類變得更加復雜。此外，線粒體基因存在漸滲雜交和基因滲透，也阻礙人蛔蟲與豬蛔蟲的準確鑒定和分類[15]。值得注意的是，Leles等[18]通過古生物學和遺傳學證據(jù)并結(jié)合最新的研究數(shù)據(jù)認為，人蛔蟲和豬蛔蟲應為同一物種，僅有輕微的表型和基因型適應性變化。本試驗采集樣品來源和數(shù)目有限，且僅鑒定了3段基因。因此，需要采集更多的野豬源蛔蟲樣品，以及利用不同的鑒定方法(線粒體全基因組、核基因和微衛(wèi)星標記等)分析野豬源蛔蟲與人蛔蟲和豬蛔蟲的分類關(guān)系。

綜上所述，本試驗利用線粒體pcox1、pnad5和核糖體ITS基因序列對湖南省長沙市瀏陽市野豬源蛔蟲分離株進行種群鑒定和種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，結(jié)果顯示野豬源蛔蟲遺傳變異程度低，判斷野豬源蛔蟲為人蛔蟲，需要更多的野豬源蛔蟲樣品和多種鑒定方法進一步鑒別。