2株嗜熱脂肪芽孢桿菌的基因組和耐藥性分析

呂 濤，孫志文，李 倩，畢言鋒，朱 奎

(1. 北京市獸藥監(jiān)察所，北京 大興 102629 ; 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193 ;3. 北京英太格瑞檢測技術(shù)有限公司，北京 海淀 100095)

近年來，隨著人們對動物源食品安全關(guān)注度逐步提高，獸藥殘留檢測技術(shù)也飛速發(fā)展，高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫吸附法等都是常用的特異性強(qiáng)且靈敏度高的檢測方法。微生物抑制藥物殘留檢測方法對設(shè)備的要求比較低，且檢測成本較低，適用于對大批量樣本進(jìn)行同時檢測。嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus,previouslyBacillusstearothermophilus)由于其培養(yǎng)條件穩(wěn)定并且對多種抗生素敏感度較高，是被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)可的、國際公認(rèn)的最常用的抗生素殘留檢測指示菌株。國標(biāo) GB/T 4789.27—2008中規(guī)定了2種檢測鮮乳中抗生素殘留的方法，嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法是其中之一[1-2]。此外，嗜熱脂肪芽孢桿菌由于其所產(chǎn)芽孢對壓力蒸汽抵抗力在大多微生物之上，被歐洲、美國等國家的藥典作為熱力滅菌生物指示劑的標(biāo)準(zhǔn)菌株[3-4]。我國衛(wèi)生部也將該菌株作為壓力蒸汽滅菌效果標(biāo)準(zhǔn)檢測菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15981—1995)。近年來，隨著對嗜熱芽孢桿菌的關(guān)注度越來越高，人們對其基因組研究也逐漸深入。已有研究表明，通過全基因組測序分析可知嗜熱芽孢桿菌中的次級代謝產(chǎn)物的種類，例如脂肽、多肽、脂肪酸、乳糖、聚合物、聚酮化合物、異香豆素類等[5]。但有關(guān)嗜熱脂肪芽孢桿菌中的質(zhì)粒研究的較少，全基因組序列中蘊(yùn)藏的信息還需要更深入地挖掘。

本試驗以2株分離所得的嗜熱脂肪芽孢桿菌為研究對象，基于基因組序列信息和耐藥性分析，探究2株嗜熱芽孢桿菌的生物特性，篩選可應(yīng)用于獸藥殘留檢測的核心菌株，以期進(jìn)一步擴(kuò)充此菌種的基因信息，為開發(fā)此類菌株提供數(shù)據(jù)支持及研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PremixExTaqVersion 2.0 (Loading dye mix)，購自TaKaRa公司；GoodView核酸染料，購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)；氨芐西林、頭孢噻肟、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、磺胺甲噁唑等，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀，美國ABI公司產(chǎn)品；電泳成套設(shè)備，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Alpha Innotech Corporation公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 16S rRNA基因序列分析 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物分別為27F:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGA-CTT-3′[6]。PCR反應(yīng)體系：2×TaqMix 10 μL；27F引物 0.4 μL；1492R引物 0.4 μL；2株分離菌株DNA模板1 μL，陽性對照組加入1 μL標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板，陰性對照組加入1 μL ddH2O，最后以ddH2O補(bǔ)足20 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán);之后72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增結(jié)束。PCR產(chǎn)物的純化與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastn工具，在GenBank中進(jìn)行同源性序列檢索，挑選同源性最近的基因序列，運(yùn)用MEGA 7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.2 全基因組測序及核心基因組進(jìn)化樹構(gòu)建 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取2株分離菌株的基因組DNA，使用NanoDrop對細(xì)菌基因組DNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測。將提取的基因組送至北京賽默百合公司在Pacbio平臺上進(jìn)行三代測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索并下載嗜熱脂肪芽孢桿菌全基因組，使用Harvest工作包內(nèi)的Parsnp(version v1.2)工具提取各分離株的核心基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。通過在線工具iTOL將構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行可視化展示。

1.3.3 質(zhì)粒序列分析 通過北京賽默百合公司Pacbio平臺進(jìn)行質(zhì)粒測序，使用Snapgene軟件構(gòu)建質(zhì)粒的標(biāo)識圖譜，使用Brig軟件對菌株攜帶的質(zhì)粒以及NCBI上下載的報道過的同種屬的質(zhì)粒進(jìn)行比對，標(biāo)注開放閱讀框的功能。

1.3.4 藥物敏感性試驗 采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laborary Standards Institute,CLSI)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法對芽孢桿菌臨床常見的10種抗菌藥物進(jìn)行抑菌活性測定。10種抗菌藥物包括：氨芐西林、頭孢噻肟、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、磺胺甲噁唑[7-8]。藥敏試驗質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)，判定標(biāo)準(zhǔn)主要依照《抗菌藥物藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)》“非高(苛)營養(yǎng)細(xì)菌金黃色葡萄球菌的敏感標(biāo)準(zhǔn)”。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因序列分析 現(xiàn)有的2株嗜熱芽孢桿菌，1株分離于腎組織的抗生素殘留檢測測試KIS試管(Commercial isolate)，另1株為實驗室保存菌株(CAU475)。為了鑒定2株分離菌株的種屬，將分離菌株的16S rRNA進(jìn)行測序并將序列提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。運(yùn)用MEGA 7.0軟件，將8株不同嗜熱芽孢菌屬的16S rRNA序列與2株分離菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性對比，其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖1所示，2株分離菌株與嗜熱脂肪芽孢桿菌同源性較高，可以將其確定為嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.2 核心基因組進(jìn)化樹分析 為進(jìn)一步了解2株嗜熱脂肪芽孢桿菌的生物特性，以及其與已報道菌株的親緣關(guān)系，從NCBI中檢索并下載4株嗜熱脂肪芽孢桿菌的全基因組序列進(jìn)行核心基因組進(jìn)化樹的構(gòu)建，其中包括作為抗生素殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)指示菌株GeobacillusstearothermophilusATCC 7953[9]。結(jié)果如圖2所示，Commercial isolate與G.stearothermophilusATCC 7953的同源性極高，與CAU475的同源性也較高，證明其可能具有相似的生物學(xué)特性。

圖2 嗜熱脂肪芽孢桿菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

將G.stearothermophilusATCC 7953作為參考菌株，將Commercial isolate和CAU475全基因組進(jìn)行相似度比較，結(jié)果如圖3所示，Commercial isolate與ATCC 7953相似度為98.85%，與CAU475相似度也高達(dá)98.67%，其差異區(qū)域為第240～300位堿基，但差異區(qū)域的具體功能還有待進(jìn)一步研究。

圖3 分離菌株與參考菌株基因組相似度

2.3 質(zhì)粒序列分析 將Commercial isolate和CAU475全基因組進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Commercial isolate中檢測到1個45 kb大小的質(zhì)粒，命名為pCOML。有關(guān)嗜熱芽孢桿菌屬基因組中質(zhì)粒的研究相對染色體的研究較少，所以本試驗對pCOML序列信息進(jìn)行了比對和標(biāo)注，以期豐富嗜熱芽孢桿菌質(zhì)粒序列信息數(shù)據(jù)庫。pGS18質(zhì)粒[10]來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌，全長63.8 kb，是NCBI收錄的序列信息較全的質(zhì)粒，以pGS18質(zhì)粒序列作為參考，將pCOML質(zhì)粒與之進(jìn)行比對，數(shù)據(jù)的計算分析顯示，pCOML全長44 814 bp，共有49個假定的開放閱讀框架(Open reading frames,ORFs)，共占82.2%。39個ORFs(79.6%)被指定為假定功能；22個ORFs(44.8%)的氨基酸序列與其他微生物蛋白的相似性較高，如圖4所示，介導(dǎo)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(traC、topB、traG、mobA)、轉(zhuǎn)錄起始位點(repE)以及部分功能蛋白 (xerC、yxlF、yokF、soJ)與已報道的pGS18質(zhì)粒相似度都在90%以上。

圖4 質(zhì)粒圖譜及開放閱讀框標(biāo)注

2.4 藥物敏感性試驗 為探究野生菌株是否可用于抗菌藥殘留檢測，選取了10種常見抗菌藥，根據(jù)生物抑制法檢測抗菌藥殘留的檢測限，進(jìn)行紙片法藥敏試驗。結(jié)果顯示Commercial isolate和CAU475對絕大多數(shù)抗菌藥都敏感(表1)，證明其可以用于抗菌藥殘留檢測的指示菌株。

表1 抗菌藥對嗜熱脂肪芽孢桿菌的藥敏試驗

3 討論

隨著人們對動物源食品安全逐漸重視，微生物抑制法殘留檢測以其成本低及方法簡便等優(yōu)點被關(guān)注[9]。嗜熱脂肪芽孢桿菌是良好的抗生素殘留檢測指示菌株，但目前能作為商品化使用的菌株數(shù)量有限。本試驗分離得到2株嗜熱芽孢桿菌分別為Commercial isolate和CAU475，經(jīng)16S rRNA測序及序列進(jìn)化樹分析，這2株芽孢桿菌與嗜熱脂肪芽孢桿菌的相似度為98.85%和98.67%。研究報道表明，G.stearothermophilusATCC 7953常作為抗菌藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)指示菌株[11-12]。基因組的相似性一定程度上顯示了生物學(xué)特性的相似性，本試驗所得2株分離菌株與G.stearothermophilusATCC 7953的基因組同源性和相似度很高，說明其具有成為抗菌藥殘留檢測候選菌株的潛力。為進(jìn)一步探究其作為抗菌藥殘留檢測菌株的可能性，本試驗參考微生物抑制法的抗菌藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)，對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株敏感性均低于檢測限，且不攜帶任何毒力基因與耐藥基因，與之前的報道一致[11]，符合生物抑制法的藥物殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)[7]，可作為候選菌株用于藥物殘留檢測。

除此之外，Stuknyte等[10]曾在嗜熱脂肪芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pGS18，且該屬質(zhì)粒具有作為基因工程工具的潛力。但該屬質(zhì)粒信息目前報道較少，目前只有3種已經(jīng)測序完全的質(zhì)粒(pSTK1、pHTA426、pLW1071)。本試驗發(fā)現(xiàn)Commercial isolate攜帶大小為45 kb的質(zhì)粒，并對質(zhì)粒功能區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注，以豐富嗜熱芽孢桿菌的基因組數(shù)據(jù)信息。與之前的研究一致，該屬質(zhì)粒除轉(zhuǎn)移原件外，79%的開放閱讀框編碼的蛋白功能不清，探究其編碼的蛋白功能可更好地將該屬質(zhì)粒用于基因工程。

本試驗將2株嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株進(jìn)行全基因組的三代測序，基于核心基因組數(shù)據(jù)分析了解菌株特性。在此基礎(chǔ)上探究了嗜熱脂肪芽孢桿菌的質(zhì)粒構(gòu)成元件，豐富了此菌株的質(zhì)粒基因組數(shù)據(jù)庫，為其作為工程性質(zhì)粒奠定了基礎(chǔ)。藥物敏感性測定為2株分離菌株作為微生物抑制劑候選菌株提供數(shù)據(jù)支持。綜上，本試驗為嗜熱芽孢桿菌的應(yīng)用及基因組數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)充提供前期理論依據(jù)。