污水環境中生物膜與混凝土防護涂層的交互作用

孔麗娟，梁增蘊，方珺，魏薇，張世武，李元元

（1.石家莊鐵道大學 省部共建交通工程結構力學行為與系統安全國家重點實驗室，石家莊 050043；2.石家莊鐵道大學 材料科學與工程學院，石家莊 050043；3.石家莊市排水管護中心，石家莊 050011）

在世界范圍內，污水環境下混凝土的耐久性問題日益突出，多數地下排污系統遭受腐蝕[1-3]，導致混凝土劣化，并帶來巨大的經濟損失。目前提高混凝土抗污水腐蝕的方法主要有：混凝土改性[4-5]、生物殺滅和涂層保護[6-7]。其中，表面涂層在工程中應用最為廣泛，按作用機制大體可分為2 類：一種是將混凝土與腐蝕介質隔離的惰性涂層，如環氧樹脂、聚酯樹脂、瀝青等[8]；另一種是通過化學或生物活性來保護基材的功能涂層[9-11]。雖然涂層在保護混凝土抵抗水、氯離子、硫酸等介質的侵蝕非常有效[12-13]，但對它在污水中的服役性能尚未得到系統研究。

污水環境下混凝土的腐蝕機制錯綜復雜，其中微生物腐蝕被認為是主要原因，特別是在混凝土污水管道的水位區附近，腐蝕往往最為嚴重[14-15]。這是因為污水的周期性浸沒可為此處微生物提供持續的營養和氧氣，有利于生物膜的形成與生長[16]。生物膜是微生物新陳代謝的主要場所，微生物的發酵、產酸、產甲烷、硫酸鹽還原等過程均發生在生物膜內[17]。不過有研究發現，生物膜的存在可減少腐蝕介質傳輸，起到保護層作用[18-19]。這可能與材料表面附著生長的生物膜厚度、致密程度等有關。很多因素都會影響生物膜的生長，如水力停留時間、有機物體積負荷、試件表面粗糙程度、水力條件等[20-22]。目前人們對污水管道混凝土保護涂層上生物膜的形成和生長知之甚少，特別是污水環境中生物膜與涂層之間的相互作用還有待深入探究。鑒于此，本研究選擇了3 種不同類型的涂層，并將其應用于硬化混凝土表面，通過配制人工強化污水進行加速試驗。系統研究了污水中有無涂層混凝土表面生物膜的生長規律和機理，并利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析了在混凝土和涂層載體上所形成的微生物群落結構。此外，對比研究了生物膜對有無涂層混凝土試件的質量及表面粗糙度影響規律。所得結果可為污水環境下混凝土表面涂層的服役性能及劣化機制提供理論依據。

1 試驗

1.1 原材料與試件制備

試驗所用原材料包括：河北鼎鑫水泥有限公司生產的P·O 42.5 水泥；粒徑為5～10 mm 連續級配的石灰巖碎石；細度模數2.8 的河北正定中砂。試驗所設計混凝土水灰比為0.5，水泥、砂子、石子的質量比為1∶1.5∶2.4，制備試件的尺寸為φ100 mm×20 mm，成形后放入溫度(20±2) ℃、相對濕度≥95%的標準環境中，養護28 d 后，將混凝土試件的側面和底部用石蠟密封，只保留試件表面用于涂刷涂層。

1.2 表面涂層

如圖1 所示，使用了3 種典型的保護涂層：無機惰性涂層（IIC）、無機殺菌涂層（IBC）和有機涂層（OC）。IIC 是一種灰色粉末涂料，它是由普通硅酸鹽水泥、石英砂和一些特殊化學物質（如堿金屬鹽等）的混合物組成；IBC 也是水泥基涂料，它是通過添加復合殺菌劑（銅酞菁、氧化亞銅和硝酸鉀的質量比為1∶1∶1）制成，故其表面顯藍色；OC 的主要成分是環氧樹脂、煤焦油瀝青。通過對比3 種涂層的SEM形貌可以發現，OC 表面最為致密，其次是IBC，而在ICC 表面可觀察到一些小孔洞。無機涂料IIC 和IBC 是先將其與水按照比例加入攪拌機內攪拌1 min，然后涂刷，厚度為4～6 mm；有機涂層則是先將涂料與固化劑充分攪拌后，等待2 min，再加入稀釋劑攪拌后即可涂刷，厚度也為4～6 mm。

圖1 3 種典型保護涂層形貌Fig.1 Morphology of three typical protective coatings

1.3 污水腐蝕裝置

自行設計并制造了污水腐蝕裝置，見圖2。主要包括：密閉有機玻璃桶，其可保持厭氧環境；自動加熱棒，可控溫在30 ℃；攪拌器，可防止污泥在底部沉積。將混凝土試件放在刷有防腐涂料的架子上，并浸入污水中，這樣生物膜可以在流動的污水環境下生長。

圖2 污水腐蝕裝置Fig.2 Sewage corrosion device: a) photo; b) top view

為加速腐蝕，人工配制了COD 值為6 000 mg/L的強化污水，其濃度約為普通污水的20 倍。活性污泥取自石家莊污水處理廠二級沉淀池，通過向其中定期添加含有淀粉、葡萄糖、蛋白胨、尿素、磷酸二氫銨等物質的營養液，可為微生物提供生長所必需的碳源、能量、氮源、磷元素等，從而使污水一直維持較高的濃度。此外，采用高通量測序技術對污水中的微生物進行檢測，可以發現其在門水平下具有較高的多樣性，主要包括變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等，三者的相對豐度高達95%，其所包含的硫酸鹽還原菌是造成混凝土微生物腐蝕的重要原因，見表1。

表1 人工強化污水中的微生物相對豐度Tab.1 Relative abundance of microorganisms in artificially intensified sewage%

1.4 方法

1.4.1 生物膜生長

生物膜生長通過稱重法測定，采用1/10 000 天平，精度為0.1 mg，量程為320 g。每隔24 h 將試件從污水中取出，稱量前將試件下表面及四周擦拭干凈。每次稱量至少重復3 次，取其平均值作為測試結果。在污水中浸泡不同時間的試件質量與浸泡前的飽水試件質量之差即為涂層表面附著生長的生物膜質量。測試周期為60 d。

1.4.2 生物膜觀察

將在污水中浸泡30 d 表面帶有生物膜的有無涂層混凝土試件取出，并用由NaCl（137 mmol/L）、KCl（2.7 mmol/L）、Na2HPO4（4.3 mmol/L）和KH2PO4（1.4 mmol/L）組成的緩沖溶液沖洗掉試件表面松散的細胞，然后刮取生物膜在吖啶橙熒光染色液中染色，并在37 ℃孵育5 min。隨后，再次取出生物膜試樣，由上述緩沖液沖洗，在FV-1000 CLSM 下觀察生物膜中細菌的存活情況，活細胞顯示綠色，死細胞顯示紅色。此外，刮取一定生物膜在稀釋的羅丹明紅色熒光染色溶液中染色，并在室溫下孵育1 h，再次沖洗后，置于CLSM 下觀察膜內微生物群落結構。激發光子和發射光子的波長分別為543、591 nm。

1.4.3 混凝土與生物膜三維形態

利用徠卡超景深測試系統（DVM5000）觀察混凝土和涂層表面的三維形貌。每個樣品隨機測試10個微區，每個微區的表面粗糙度可以通過式（1）用最小二乘法線性擬合來計算，然后取平均值。

2 結果與分析

2.1 生物膜表觀形態觀察

將有無涂層的混凝土試件置于含人工污水的生物膜反應器中，觀察不同階段生物膜的表觀形貌。從圖3 可以看出，在最初的幾天，混凝土表面形成了少量的細菌菌落。隨著時間的增加，這些細菌菌落慢慢聚集，生物膜的數量開始增加，最終形成了完整成熟的生物膜。從CLSM 圖像中也可看出，隨著生長周期的延長，生物膜內微生物及其分泌產生的胞外聚合物逐漸增多，生物膜結構也越發致密。此外，試件表面生物膜的顏色由泥灰色變為黃色，最后變為黑色。其中，無涂層混凝土試件的生物膜生長速度和變色速度最快，IIC 和IBC 的生物膜生長速度均慢于無涂層混凝土試件，而機涂層混凝土試件的生物膜生長速度最慢。這可能是因為涂層表面比混凝土表面更光滑、更致密，尤其是有機涂層。

在污水中，懸浮的微生物細胞通過主動和被動運輸附著在載體表面，并通過吸收和消耗水中有機基質實現自身的繁殖和生長。同時，這些細胞產生大量的胞外聚合物（EPS），進一步將微生物細胞緊密結合，形成生物膜。隨著生物膜的積累，在水力剪切作用下，不斷將微生物細胞釋放到水中。故載體上生物膜的形成是一個受附著、生長和脫離影響的動態過程，如圖4a 所示。載體粗糙度對生物膜形成和生長的影響可從以下2 方面來解釋：一方面，粗糙載體表面的凹坑可以為微生物提供一個相對靜止的流動環境，減少水流的剪切侵蝕，保護微生物；另一方面，粗糙載體具有較大的表面積，可增加其捕獲微生物的能力，見圖4b。因此，表面粗糙的載體比表面光滑的載體更有利于生物膜的附著和生長。

圖4 生物膜形成示意圖Fig.4 Schematic diagram of biofilm formation: a) smooth carrier; b) rough carrier

2.2 生物膜的生長變化

有無涂層的混凝土試件（UCS）上形成的生物膜生長曲線如圖5 所示。可以看出，附著在UCS 上的生物膜質量最高，其次是IIC，第三是IBC，最后是OC。UCS 上生物膜的最大質量約為OC 的2 倍。此外，附著在混凝土試件表面的生物膜的生長曲線可分為5 個階段。最初的7～9 d 為階段1 附著期，微生物借助于水力或其他擴散力遷移到載體表面，生物膜量迅速增加。接下來的5～7 d 是階段2 適應期，此時附著的微生物處于平衡狀態，以適應反應器內環境。隨后的18 d 是階段3 生長期，在此期間，由于營養物質的充分供應，微生物開始迅速生長和繁殖。32～40 d是階段4 穩定期，生物膜的脫落與生長在各種外力作用下處于動態平衡。階段5 是40～60 d 的脫落期，生物膜量逐漸減少，表明隨著生物膜的成熟，膜內微生物的分解及膜內厭氧層過厚等原因導致部分生物膜脫落。此外，生物膜在混凝土試件上的附著期比在涂層載體上的附著期短，而其生長期較長。異養生物膜和硝化生物膜也有類似的觀察報告[23-24]。不過其沒有明顯的指數增長階段，而很快進入了穩定的線性增長。這可能與生物膜各形成階段的人為劃分有關。如果將適應期的后期分為生長期，則在生物膜的生長過程中也會出現指數生長期。

圖5 生物膜在不同載體上的生長曲線Fig.5 Growth curve of biofilm on different carriers

2.3 生物膜的生長動力學

從上述結果可以看出，生物膜的形成涉及2 個主要的動力學生長過程:附著階段和生長階段。這2 個過程有助于生物膜的積累和形成，可以認為是生物膜生長的主要階段。因此，下面重點介紹這兩部分的動態數學模型。

2.3.1 生物膜可逆附著動力學

當微生物與混凝土載體剛剛接觸的時候其實就已經形成了可逆附著，這一過程實際上是微生物在載體表面吸附與脫附的雙向動態過程。因為在微生物生長的環境中，存在著流體動力或者簡單的布朗運動，這都是導致微生物脫附的原因。微生物可逆附著的概念是由Marshall 等人明確提出的，并且此過程遵循一級反應準則[25]，所以微生物的固定速度可以表示為[26]：

式中：Xfe為平衡狀態下微生物附著量，g/L；X0為微生物初始濃度；Xe為平衡狀態下的懸浮微生物質量濃度，g/L。

采用方程（10）對附著階段有無涂層混凝土試件的表面生物膜質量進行擬合，結果見圖6。可以看出，所有相關系數均在0.982 85～0.991 47，表明擬合結果良好，可將此式作為附著階段生物膜質量的數學模型。此外，附著在載體表面的微生物量主要受到載體表面粗糙度影響，載體表面越光滑，系數α越接近1。UCS 載體的α最小，說明其表面最為粗糙，其次是ICC，而IBC 和OC 的α接近1，說明它們表面最光滑。IBC 載體的系數α略大于1，這可能表明載體的殺菌性導致生物膜量進一步減少。

圖6 附著階段不同載體生物膜測量值與擬合曲線比較Fig.6 Comparison of measured values and fitted curves of biofilms on different carriers during attachment stage

2.3.2 生物膜生長動力學

現在工程中廣泛應用的生物膜生長動力學模型為Mond 方程[27]：

式中：μ為微生物比生長速率，h–1；μmax為微生物最大比生長速率，h–1；Cs為限制性底物質量濃度，mg/L；Ks為半飽和常數，mg/L。

本研究中由于人工強化污水的有機物含量較高，Cs>>Ks，故生物膜生長不會受到限制，此時Mond 方程可轉化為零級反應式，即μ=μmax。因此，微生物生物膜的生長符合Mond 方程，故理論上生物膜的質量應隨時間線性增長。在不同載體上生物膜的生長動力學曲線如圖7 所示。可以看出，它們基本上都呈線性。試驗數據擬合后的相關系數大于0.98，表明擬合結果與實測值吻合較好。擬合直線的斜率和截距可以分別代表適應期最后的微生物生長率和生物膜質量。顯然，無涂層混凝土試件上的生物膜生長速率和質量明顯高于有涂層的試件。總體來看，本試驗中的生物膜的生長動力學相對符合Monod 方程。

圖7 生長階段不同載體生物膜測量值與擬合曲線比較Fig.7 Comparison of measured values and fitted curves of biofilms on different carriers during growth stage

2.4 生物膜中細菌活性與微生物菌群結構

2.4.1 生物膜內死活細胞分布

采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察生物膜內的細胞分布，在相同深度觀察附著在生物膜表面與不同涂層的生物膜，如圖8 所示。綠色代表活細胞，紅色代表死細胞。

從圖8a、b 可以看出，附著在UCS 和IIC 表面的生物膜中含有較多的微生物，并且綠色區域明顯大于紅色區域，表明活細胞的數量遠遠大于死細胞。然而在圖8c、d 中只能觀察到少量細胞，且活細胞數量明顯減少，表明附著在IBC 和OC 表面的生物膜在細胞數量及活性方面均不及UCS 和IIC 表面的生物膜。這是因為IBC 中含有銅酞菁和氧化亞銅，具有一定的殺菌功能，通過與微生物所需代謝的酶相結合，從而減緩其活性，抑制微生物的生長繁殖[28]。OC 中的煤油瀝青成分中也含有一定有毒物質，能夠破壞微生物的細胞結構，其中的環氧樹脂在能一定程度上能夠抵抗微生物的攻擊。

圖8 不同載體生物膜中活、死細胞分布Fig.8 Distribution of live/dead cells within the biofilm attached to different carriers

2.4.2 生物膜內微生物的空間分布

對生物膜從頂部（接近污水）向底部（接近載體）進行逐層掃描，得到的CLSM 圖像如圖9 所示。可以發現，當生物膜接近載體時，其內部的微生物數量較少。通過圖像分析軟件對CLSM 圖像進行分析，可得到附著在不同載體上的生物膜內不同深度處細胞與胞外聚合物面積分數，結果見表2。可以看出，附著在UCS 上的生物膜內，細胞總數沿測試深度從25.3%下降到4.5%。當在混凝土表面涂覆涂層后，生物膜內細胞及胞外聚合物分數均出現大幅度下降，尤其是附著在OC 和IBC 表面的生物膜，頂面細胞及胞外聚合物的面積分數僅為3.9%和1.5%。胞外聚合物是由細菌細胞產生的生物聚合物，其分布與細胞一致，面積分數也隨深度增加而減小。附著在混凝土載體上的膜內胞外聚合物比涂層載體多。這可能是由于涂層的光滑表面和殺菌特性增加了生物膜的脫離和降解速率，導致生物膜中胞外聚合物的分數降低。例如，在距表面20 μm 深度時，附著在IBC 和OC 上的膜內胞外聚合物分數僅為0.2%和1.1%，而附著在UCS 上的則約為15.7%。

表2 不同深度生物膜內細胞和EPS 的面積分數Tab.2 Area fraction of cells and EPS within the biofilm at different depth%

圖9 生物膜由上到下不同深度的CLSM 圖像Fig.9 CLSM images of biofilm taken at different depth from top to bottom

2.5 污水中有混凝土有生物膜的性能研究

為了研究污水環境中生物膜對有無涂層混凝土試件的腐蝕影響，控制一組試件的表面生物膜自由生長，而另一組試件上形成的生物膜則每天被沖刷掉。

2.5.1 質量變化

在污水環境下浸泡90 d 后，測試不同混凝土試件在有無生物膜附著下的質量變化規律，結果見圖10。可以看出，無涂層混凝土試件的質量損失高于涂層混凝土試件，表明3 種涂層均能保護混凝土免受污水腐蝕。其中，有機涂層OC 對防止混凝土因污水微生物腐蝕引起的劣化效果最好，其次是IBC 和IIC。顯然，除了涂層的物理阻隔作用外，其殺菌功能也非常重要。此外，無生物膜試樣的質量損失顯著高于有生物膜試樣。例如，有無生物膜附著的試件UCS 的質量損失分別為8.1%和12.7%，而試件OC 的質量損失分別僅為3.2%和4.2%。

圖10 污水中有無生物膜混凝土試件的質量變化Fig.10 Mass change of concrete specimens with and without biofilm in sewage

2.5.2 表面粗糙程度

在污水環境下浸泡90 d 后，有無涂層的混凝土試件表面的三維形貌如圖11 所示。可以看出，混凝土試件在有涂層保護的情況下表面更加光滑、致密，并且無生物膜附著的試件表面更加粗糙，說明生物膜可在一定程度上起到保護層作用。

圖11 污水腐蝕后有無生物膜混凝土試件的三維形貌Fig. 11 Three-dimensional morphology of concrete specimens with and without biofilm after sewage corrosion: a) with biofilm; b) without biofilm

通過每個試樣隨機測試10 個微區，并用最小二乘線性擬合方法計算每個微區的表面粗糙度，取其平均值。此外，生物膜作用系數可以通過式（12）計算。生物膜的作用系數越高，生物膜對砂漿的保護作用越強。

式中：KB為生物膜的作用系數；R1、R0分別為沒有和有生物膜附著樣品的平均表面粗糙度，μm。

根據表3 可以看出，有無生物膜附著的試件UCS表面平均粗糙度分別為48.7、81.4 μm，而OC 的表面平均粗糙度分別僅為10.3、12.9 μm。另外，無涂層混凝土試件表面的生物膜作用系數最高，為0.67，ICC 次之，為0.51。說明雖然污水腐蝕后試件UCS的表面粗糙度較高，但其表面形成的厚而密的生物膜可作為物理屏障，降低污水的滲透性。對于IBC 和OC 試件，它們的生物膜作用系數都較低，分別僅為0.22 和0.25。這可解釋為涂層的光滑表面和殺菌性減少了生物膜的生長，形成的生物膜層更薄，且結構疏松多孔。

表3 污水腐蝕后不同混凝土試件的表面粗糙度Tab.3 Surface roughness of different concrete specimens after sewage corrosion

3 結論

1）UCS 上形成的生物膜量最多，其次是IIC、IBC和OC。生物膜在混凝土和涂層表面的生長規律基本遵循載體表面越粗糙，附著生物膜越多的原則，但有一個例外，雖然IBC 的表面粗糙度大于IIC，但附著在IBC 的生物膜量小于IIC，表明載體的生物適應性也會影響生物膜的生長。

2）生物膜在涂層表面生長的附著階段要比混凝土表面更長，生長階段則較短。公式mf=mfe(1－αe–at)可作為計算附著階段生物膜質量的數學模型，而對于生長階段，也總體上符合Monod 方程，即生物膜質量隨時間增長呈線性增加。

3）污水腐蝕90 d 后，無生物膜附著試件的質量損失和表面粗糙度均高于有生物膜附著的試件。其中，無涂層混凝土試件表面的生物膜作用系數最高，為0.67，ICC 次之，為0.51，說明試件表面形成的厚而密的生物膜可作為物理屏障，降低污水的滲透性，而試件IBC 和OC 的生物膜作用系數僅為0.22 和0.25。由此可見，涂層的光滑表面和殺菌特性會導致形成的生物膜薄且多孔，從而降低生物膜的保護效果。