兒童重癥肺炎支原體肺炎支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞因子變化及臨床意義分析

王潔 王丹丹 張薇 縱書芳 王寅

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是引起兒童呼吸道感染的常見病原體,肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)成為兒童社區獲得性肺炎的主要類型之一,占15%～40%［1-3］。近年來,兒童MPP 發病率呈現逐年增長趨勢,且重癥MMP(severe mycoplasma pneumoniae pneumonia,SMMP)占比也逐年升高,不僅增加治療難度,且除肺部癥狀及體征外,還極易引起心肌炎、肝炎等肺外并發癥［4］。SMPP 的發病機制尚不完全明確,多項研究表明細胞免疫所介導的炎癥反應與其發生及發展有關,且有研究顯示MMP 患兒的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中多項炎癥細胞因子呈現明顯異常變化［5］。目前,相關研究多集中于病情嚴重程度與BALF 中炎癥細胞因子水平的相關性研究,涉及SMMP患兒BALF 中炎癥細胞因子水平變化與MP-DNA 載量、轉歸等的關系研究較少。因此,本研究就此開展相關研究和分析,以期為兒童SMPP 的臨床診治提供一定的參考依據,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月～2021 年6 月在本院接受支氣管肺泡灌洗術的66 例SMPP 患兒為SMPP組。納入標準：①符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015 年版)》［6,7］中對SMMP 的診斷標準；②具有支氣管鏡術以及肺泡灌洗指征；③年齡1～14 歲,首次發病；④痰培養顯示未合并細菌、病毒、真菌等感染；⑤臨床資料完整。排除標準：①合并支氣管哮喘、肺結核等其他呼吸系統疾病患兒；②入院時已行氣管插管或切開、機械通氣(mechanical ventilation,MV)患兒；③合并血液系統疾病、免疫系統疾病、心腦血管系統疾病、惡性腫瘤患兒；④合并嚴重心、肝、肺、腎等原發性疾病患兒；⑤近期嚴重創傷、手術患兒；⑥蕁麻疹、濕疹及過敏性鼻炎等過敏狀態患兒。另選同期因支氣管異物入院需行支氣管鏡術以及肺泡灌洗的非SMPP 患兒66 例為非SMPP 組,異物吸入時間≤1 d,近6 個月內無肺部感染史,其余排除標準同SMPP組。SMPP 組患兒年齡1～13 歲；非SMPP 組患兒年齡1～13 歲。兩組患兒一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。SMPP 組根據中華醫學會兒科急救學組提出的小兒危重病例評分(pediatric critical illness score,PCIS)［8］進一步分為非危重組(81～100 分,34 例)、危重組(71～80 分,25 例)與極危重組(0～70 分,7 例)；病程中發生呼吸衰竭需行MV 患兒作為MV 組(29 例),無需MV 患兒為非MV 組(37 例)。本次研究獲得患兒家長的知情同意,且研究設計經過醫院倫理委員會審核并批準通過。

表1 兩組患兒一般資料比較［n(%),］

表1 兩組患兒一般資料比較［n(%),］

注：兩組比較,P＞0.05

1.2 主要儀器與試劑 人細胞因子酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒由美國R&D 公司提供；離心機為美國 Eppendorf 公司生產；纖維支氣管鏡為日本Olympus 公司生產；Rayto全自動酶標儀(RT6100)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀由美國BD 公司提供；電子支氣管鏡(BF-XP260F)由奧林巴斯提供。

1.3 研究方法

1.3.1 BALF 采集 兩組患兒均接受纖維支氣管鏡檢查或治療,根據《支氣管肺泡灌洗液細胞形態學檢驗中國專家共識(2020)》［9］和《中國兒科可彎曲支氣管鏡術指南(2018 年版)》［10］中關于兒童BALF 的采集標準要求施行。選取一側支氣管或患側支氣管肺段,采用37℃無菌生理鹽水(總量＜3 ml/kg)分3 次進行灌洗,留取灌洗液5 ml,采用雙層無菌紗布進行過濾去除黏液,然后轉移至離心管中。BALF 樣品在4℃溫度下,以轉速1200 r/min 離心10 min,分離上清液,保存于4℃冰箱中于24 h 內統一測定。

1.3.2 檢測方法 采用雙抗體夾心ELISA 法檢測BALF 中炎癥細胞因子,包括白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)。MP-DNA 載量采用PCR 熒光探針法進行檢測,具體操作步驟按照試劑說明書嚴格執行。SMPP 組于急性期和恢復期各測1 次。

1.4 觀察指標 比較SMPP 組患兒急性期和非SMPP組患兒BALF 中炎癥細胞因子水平；SMPP 組不同病情、不同危重程度患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子及MP-DNA 載量,急性期與恢復期BALF 中炎癥細胞因子水平。分析SMPP 組患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子與MP-DNA 載量的相關性。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料采用非參數檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關性采用Pearson 線性相關性分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒BALF 中炎癥細胞因子水平比較SMPP組患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 均顯著高于非SMPP 組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組患兒BALF 中炎癥細胞因子水平比較()

表2 兩組患兒BALF 中炎癥細胞因子水平比較()

注：與非SMPP 組比較,aP＜0.05

2.2 SMPP 組不同病情患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子及MP-DNA 載量比較 MV 組患兒急性期BALF中MP-DNA 載量、IL-1β、IL-6 水平顯著高于非MV 組,差異具有統計學意義(P＜0.05)；兩組患兒急性期BALF中IL-2、IL-4、INF-γ 及IL-4/IFN-γ 比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 SMPP 組不同病情患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子及MP-DNA 載量比較()

表3 SMPP 組不同病情患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子及MP-DNA 載量比較()

注：與非MV 組比較,aP＜0.05

2.3 SMPP 組不同危重程度患兒BALF 中炎癥細胞因子水平及MP-DNA 載量比較 隨著病情程度的加重,SMPP 患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 及MP-DNA 載量呈顯著升高趨勢,非危重組、危重組、極危重組比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 SMPP 組不同危重程度患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子水平及MP-DNA 載量比較()

表4 SMPP 組不同危重程度患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子水平及MP-DNA 載量比較()

注：三組比較,P＜0.05

2.4 SMPP 組患兒急性期與恢復期BALF 中炎癥細胞因子水平比較 SMPP 組患兒恢復期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和IL-4/IFN-γ均明顯低于急性期,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表5。

表5 SMPP 組患兒急性期與恢復期BALF 中炎癥細胞因子水平比較(,n=66)

表5 SMPP 組患兒急性期與恢復期BALF 中炎癥細胞因子水平比較(,n=66)

注：與急性期比較,aP＜0.05

2.5 SMPP 組患兒急性期BALF 中炎癥細胞因子與MP-DNA 載量的相關性分析 Pearson 相關性分析顯示：SMPP 組患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 均 與MP-DNA 載量呈顯著正相關性(r=0.513、0.402、0.336、0.509、0.502、0.324,P＜0.05)。

3 討論

MPP 的發病機制目前尚不完全明晰,主要認為與上皮細胞吸附、病原直接侵入及免疫學因素等有關,而免疫應答紊亂被認為是MPP 發生及發展的重要因素之一［11］。在MPP 感染初期,因免疫失衡與免疫逃逸等可導致MP 逃避宿主的免疫監視,從而導致病情進展［12］。不同于血液標本,BALF 直接來源于病變周圍,能夠更為客觀、準確、直接地反映感染后呼吸系統免疫紊亂情況［13］。

抗炎與促炎系統平衡情況直接影響肺炎患者的病情變化及臨床轉歸,多種炎性標記物如IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 等細胞因子被作為評價肺炎病情嚴重程度的生物指標［14］。IL-2、IL-γ 均是代表性的Th1 細胞因子,可促進自然殺傷(NK)細胞增殖、提高T 細胞殺傷活性,促進機體清除感染源；IL-1β、IL-4、IL-6 均是代表性的Th2 細胞因子,能夠刺激B細胞及T 細胞等分化成熟,具有抗炎效應［15］。因此,Th1 和Th2 細胞因子平衡有利于機體防御反應。從理論角度而言,Th1 型細胞因子具有促炎作用,而Th2 細胞因子具有抗炎效應,故兩者平衡有利于機體防御反應。但IL-4 等過表達時,可大量激活B 細胞釋放免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G1(IgG1)等,誘發喘息癥狀［16］。IL-6 對于宿主早期炎癥反應具有重要調節作用,在細菌感染后數小時內即可達峰,而在非細菌感染中僅在重癥感染時有明顯增高,故IL-6 過表達也往往提示感染較為嚴重［17］。研究表明,MMP 急性期呈現Th1/Th2 免疫應答平衡向Th2 應答漂移,這種免疫反應失衡反而加重肺損傷［18］。

本研究結果顯示,SMPP 組患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 均顯著高于非SMPP 組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示SMPP 可引起BALF 中多種細胞因子高表達,且呈現Th2 優勢表達趨勢,這與黃小霏等［19］報道基本相符。分析其原因,MP 感染后肺組織免疫功能紊亂,促炎因子升高,為保護機體免疫平衡,抑炎因子也呈升高趨勢,導致細胞因子整體過表達。本研究還顯示,SMPP 中MV 組患兒IL-1β 和IL-6 水平明顯高于非MV 組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示BALF 中IL-1β 和IL-6 表達越高的SMPP 患兒可能具有更高的呼吸衰竭風險,但其他炎癥因子可能對是否發生呼吸衰竭的評估價值有限。進一步采用PCIS 評分進行分組,隨著病情加重,BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 表達水平、IL-4/IFN-γ 值均呈現顯著升高趨勢,比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。提示BALF中炎癥細胞因子與SMPP 的病情嚴重程度有關,檢測BALF 中炎癥因子有助于評估SMPP 患兒的病情變化。進一步比較SMPP 組急性期與恢復期BALF 中炎癥細胞因子表達情況顯示,恢復期后IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 表達明顯降低,且IL-4/IFN-γ 比值下降,更趨向平衡。進一步證實在SMPP 患兒中,BALF細胞因子表達情況與病情、轉歸等均有一定關系,這為臨床評估病情和治療干預提供了一定的理論依據。MP-DNA 載量是評價MP 活動狀況的主要指標,本研究中,MV 組患兒BALF 中MP-DNA 載量明顯高于非MV 組患兒,且隨著病情加重呈顯著增高趨勢。進一步相關性分析顯示,MP-DNA 載量與IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN -γ 均具有顯著正相關性(P＜0.05),方柯南等［20］研究也獲得了類似結論。提示MP-DNA 載量高可能與SMPP 患兒的過度免疫反應有關,但其是否與患兒全身免疫功能亢進的發生及維持有關尚不明確。

綜上所述,兒童SMPP 急性期BALF 中MP-DNA 載量越高,BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN -γ 越高,且病程中因呼吸衰竭需行MV 的患兒BALF 中MP-DNA 載量及炎癥因子水平明顯高于無需MV 的患兒。提示檢測BALF 中MP-DNA 載量及IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 等細胞因子水平對病情評估具有一定的指導意義。