Smad4、Caveolin-1在肺腺癌中的表達及與預后的關系

邵偉偉 鄒琳 蘭建云 劉水 王樹人 黃炎

據GLOBOCAN 2020全球癌癥統計數據[1]，在世界范圍內肺癌位居男性癌癥發病率及死亡率第一位，女性癌癥發病率第三位，死亡率第二位，其占癌癥總體死亡率為18.0%,嚴重危害人們身心健康。隨著人們生活方式的改變、大氣污染的日益嚴重以及分子檢測水平的提高，在總人群中肺腺癌的發病率較其他類型呈顯著上升趨勢，且腺癌更易出現淋巴結轉移、胸膜侵犯及遠處轉移，本實驗通過研究抑癌基因Smad4、Caveolin-1蛋白在肺腺癌及正常肺組織中的表達，分析它們與臨床病理因素及預后的關系，為分子診斷、預后評估和治療積累臨床數據。

資料與方法

一、資料

收集2016年1月-2019年6月鹽城市第一人民醫院手術切除的浸潤性肺腺癌標本130例，術式為肺段或肺葉切除，同時取癌周3CM以外正常肺組織作為對照組。所有組織均采用中性福爾馬林固定后常規石蠟包埋、切片、HE染色。全部病例術前均未行放、化療及靶向治療，均有完整的病歷資料和隨訪記錄，隨訪截止日期為2021年8月。2位高年資病理醫師重新閱片以進一步明確組織學分級及臨床分期。本實驗通過南京大學醫學院附屬鹽城市第一人民醫院倫理委員會批準(2021-K-88)。

二、方法

1 Smad4、Caveolin-1免疫組化檢測 使用LEICA BOND-MAX全自動免疫組化儀行免疫組化檢測，所用一抗分別為Smad4(兔單抗，克隆號SP306，1 ∶100，Abcam公司)及Caveolin-1(兔單抗，克隆號SP43，1 ∶100，Abcam公司)。SP試劑盒同樣購自Abcam公司。實驗步驟分別按說明書進行，用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照片，已知陽性片作為陽性對照片。

2 結果判斷 Smad4陽性染色定位于細胞漿和(或)細胞核中，Caveolin-1陽性染色定位于細胞漿和(或)細胞膜中，陽性著色均呈淡黃、棕黃或棕褐色。每張切片隨機計數》500個腫瘤細胞，著色細胞≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分；染色強度依據未著色、著淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0～3分。將每張切片著色細胞的數量和染色強度得分相加進行半定量評價，0～1分為(-)，2～3分為(1+)，4～6分為(2+)，>6分為(3+)。

三、統計方法

采用spss11.5統計分析軟件對相關數據進行統計處理。率得比較采用Pearson χ2檢驗和McNemar配對χ2檢驗，應用Spearman等級相關分析兩指標間的關系，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，應用Log-rank檢驗進行比較。檢驗水準均采用α=0.05。

結 果

一、臨床病理特征

患者年齡42～89歲，平均年齡(62.75±9.48)歲，男性61例(46.92%)，女性69例(53.08%)，吸煙43例(33.08%)，腫塊中位大小3 cm，有淋巴結轉移38例(29.23%)，發生在左肺52例(40.00%)，右肺78例(60.00%)。據2017年國際抗癌聯盟發布的第8版肺癌TNM分期標準，Ⅰ期71例(54.62%)，Ⅱ期50例(38.46%)，Ⅲ期 9例(6.92%)，根據顯微鏡下組織學形態(乳頭型、微乳頭型、實體型、腺泡型、貼壁型及篩樣型)確定分化程度，其中高分化41例(31.54%)，中分化40例(30.77%)，低分化49例(37.69%)。

二、Smad4、Caveolin-1蛋白在正常肺組織及肺腺癌組織中的表達

Smad4、Caveolin-1免疫組化陽性表達(見圖1)，兩者在正常肺組織中的表達率分別為90.77%(118/130)、96.15%(125/130)，在肺腺癌組織中的表達率分別為66.15%(86/130)、41.54%(54/130)，差異均有統計學意義(P均<0.001)(見表1)。

三、肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白的表達與臨床病理因素的關系

圖1 Smad4陽性染色定位于細胞漿和(或)細胞核中(SP×100)，Caveolin-1陽性染色定位于細胞漿和(或)細胞膜中(SP×100)

表1 Smad4、Caveolin-1蛋白在正常及肺腺癌組織中的表達

130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白的表達均與有無淋巴結轉移、組織分化程度及TNM分期相關(P均<0.05)，Smad4在淋巴結轉移組、組織分化差組及高TNM分期組中的表達顯著下降，Caveolin-1在淋巴結轉移組、組織分化差組及高TNM分期組中的表達顯著升高。本實驗未發現二者的表達與患者性別、年齡、腫塊發生部位、有無吸煙及腫塊大小有關(P均>0.05)(見表2)。

表2 Smad4、Caveolin-1的表達與臨床病理因素間的關系[n(%)]

四、130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白表達的相關性

本實驗中，兩蛋白共陰性表達30例，共陽性表達40例，86例Smad4陽性表達組中Caveolin-1蛋白陽性表達率為46.51%(40/86)，44例Smad4陰性表達組中Caveolin-1蛋白陽性表達率為31.82%(14/44)，統計學分析發現兩者的表達呈正相關(r=0.895，P<0.001)(見表3)。

表3 130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白表達的相關性

五、130例肺腺癌組織中Smad4、Caveolin-1蛋白的表達與患者預后的關系

通過電話隨訪及門診復查相結合獲得130例肺腺癌患者的隨訪資料，隨訪率100%，死亡39例，總中位生存時間31.5個月。Smad4陰性表達組及陽性表達組中位生存時間分別為30、39個月，logrank檢驗發現兩組間的差異有統計學意義(χ2=22.990，P<0.001)。Caveolin-1陰性表達組及陽性表達組中位生存時間分別為42、33個月，logrank檢驗發現兩組間的差異有統計學意義(χ2=4.170，P=0.041)(見圖2，3)。

圖2 Smad4陽性與陰性的生存曲線

圖3 Caveolin-1陽性與陰性的生存曲線

130例患者中有128例進行了EGFR基因檢測，其中78例檢測出有存在18/19/20/21號外顯子突變，術后有43例接受了酪氨酸激酶抑制劑治療，71例接受了化療、放療和(或)抗血管生成藥物治療，16例未接受任何治療。統計學分析發現Smad4、Caveolin-1陽性表達組的患者術后接受輔助治療的預后顯著優于未治療組(P均<0.001)(見表4，5)。

表4 術后未治療組及治療組間Smad4陽性表達患者的預后[n(%)]

表5 術后未治療組及治療組間Caveolin-1陽性表達患者的預后[n(%)]

討 論

肺癌的發生、發展、轉移涉及到復雜的分子機制，近年來靶向用藥顯著改善了患者的預后和生活質量，目前已明確EGFR/Braf/Kras/Nras/ALK/ROS1/HER-2/PIK3A等是靶向用藥的靶基因，但是這些基因的突變并沒有覆蓋整個人群，有報道[2]EGFR的突變在總人群中為40%～50%，ALK為3%～7%，ROS1僅為1%～3.4%，其它位點則更為罕見，同時還有靶向藥物耐藥的問題，因此有必要研究其它癌基因或抑癌基因。

Smad4蛋白由胰腺癌位點4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4，DPC4)編碼，于1996年被首次確認為抑癌基因[3]，屬于Smad家族成員之一。Smad家族是一組直接將細胞外信號轉導到細胞核的蛋白，共有8種不同的Smads，其中Smad4是調節轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信號轉導的中樞細胞內介質，已發現其在多種實體腫瘤[4-6]中低表達或缺失表達，與腫瘤發生、發展密切相關，在肺腺癌中，同樣發現Smad4缺失表達的患者預后較差，是獨立的預后因子[7]。在本組實驗中我們發現Smad4在癌周正常肺組織中的表達率較癌組織顯著升高，差異有統計學意義，提示Smad4作為抑癌基因，其表達缺失參與了腫瘤的發生。TNM分期是評估患者預后的重要指標，涉及到癌細胞的遷徙能力、上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)、促血管增生等過程，我們在分析Smad4與臨床病理因素間關系時，發現隨著癌組織轉移至淋巴結、分化程度降低及TNM分期的升高，其陽性表達率顯著下降，結合隨訪結果，提示Smad4表達下調促進了肺癌的侵襲性生物學行為，縮短了患者生存時間。Smad4在肺腺癌中的分子作用機制有以下可能： Takahashi[8]通過對一種抑制TGF-β1的抗過敏藥物(曲尼司特)在非小細胞肺癌細胞株中的研究發現，該藥物通過抑制癌細胞中Smad4的表達進而抑制了TGF-β1誘導的EMT和細胞侵襲、轉移，證實了TGF-β/Smad4信號通路在癌細胞增殖、轉移過程中的作用。 Smad4通過形成同源或異源絡合物，轉移到核內，與其他轉錄因子共同調控TGF-β的轉錄，而TGF-β可誘導新生血管的形成和抑制腫瘤組織內部及周圍的細胞免疫反應，Smad4表達的下調，減弱了對TGF-β的調控，降低了腫瘤微環境中的免疫反應，促進了血管新生。 TGF-β/Smad4信號通路是上皮-間充質轉化的主要信號通路之一，通過啟動和轉導上皮細胞表面受體結構的改變，進而影響上皮間質化，從而促進腫瘤細胞增和惡性進展。

小窩蛋白(Caveolae)又稱胞膜窖，是細胞膜表面富含鞘脂和膽固醇的特異性的內陷囊狀結構，廣泛分布于內皮細胞、上皮細胞中，與分子運輸、細胞粘附和信號轉導有關。小窩蛋白1(Caveolin-1)為其結構蛋白，是形成內陷囊狀結構所必不可少的，位于7號染色體上，有三個外顯子，其架構區具有激酶抑制活性，能夠抑制內皮生長因子受體(EGFR)、Raf、G蛋白、c-Src酪氨酸激酶、MEK21和ERK22等因子活性[9]，從而參與多種細胞事件如免疫反應、胞吞作用、膜轉運、細胞信號轉導等[10]。其在腫瘤中的表達情況文獻報道不一致，有報道在結直腸癌、卵巢癌中表達下調[11-12]，而在宮內膜癌、乳腺癌、肝細胞肝癌、前列腺癌、胰腺癌中表達上調[13-15]。Shimizu[16]和Eleonora[17]分別通過對412例和116例肺腺癌組織及細胞標本的研究中均發現Caveolin-1陽性表達的病例較陰性病例更易出現胸膜和血管侵犯，無進展生存率顯著降低，提示Caveolin-1參與肺腺癌的惡性進展。本實驗發現Caveolin-1在正常肺組織中的陽性表達率顯著高于腺癌組織，但是隨著腫瘤臨床進展(低分化、高TNM分期、出現淋巴結轉移)其陽性表達程度反而升高，這種現象有學者認為是階段依賴的，早期Caveolin-1下調發揮抑癌功能，晚期Caveolin-1上調發揮致癌作用[18]。Caveolin-1主要通過架構區發揮抑癌活性，當架構區以外的氨基酸位點發生磷酸化或突變，會導致架構區激酶抑制活性丟失，激活下游細胞內信號轉導途徑(如EGFR/ERK/FAK/AKT等)，促進腫瘤細胞的增殖，其中EGFR已被證實是肺癌靶向治療的最重要的基因位點。有研究[19]說明，在高轉移能力的肺腺癌細胞系中，Caveolin-1的表達高于低轉移能力的細胞系，Caveolin-1的高表達能夠促進癌細胞偽足的形成，從而提高腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。分析隨訪資料發現陽性表達者，術后生存時間及生存率均較陰性表達者顯著下降，提示其作為腫瘤抑制因子的同時，還具有促進腫瘤進展和轉移的活性。

我們的研究還發現Smad4、Caveolin-1在肺腺癌中的表達呈正相關，說明兩者在致癌、促癌過程中既具有不同的分子機制又可能存在共同的影響因子，例如細胞外調節蛋白激酶(ERK)。如前所述，當Caveolin-1的架構區激酶抑制活性丟失時，可激活細胞內ERK信號通路，而TGF-β在影響Smad4信號分子的同時亦可活化ERK信號通路。結合兩者在肺腺癌中的缺失或者升高表達均與肺腺癌的惡性生物學進展及較差預后密切相關，提示兩者可作為潛在的評估預后及靶向治療的靶點。