EFNA2基因在肺腺癌中表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的臨床意義

舒守宏 陳久紅 汪婷

肺癌是世界范圍導(dǎo)致癌癥死亡的最常見(jiàn)原因之一[1]，肺癌總?cè)巳旱?年相對(duì)生存率約為15%～20%[2]。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌人群的85%而肺腺癌(lung adenocarcinoma， LUAD)約占非小細(xì)胞肺癌50%的新發(fā)病例，是最常見(jiàn)的病理類型[3]。免疫治療和靶向治療是目前LUAD治療中重要的輔助手段，但目前的治療效果仍然不甚理想[4-6]。肝配蛋白A2(EFNA2)是編碼肝配蛋白家族的重要成員，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生有明顯的相關(guān)性，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其可能通過(guò)參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，破壞內(nèi)皮屏障和參與免疫逃逸等機(jī)制參與腫瘤進(jìn)程[7-9]。然而，EFNA2在LUAD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的分子生物學(xué)機(jī)制目前尚不明確。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法探索EFNA2基因在肺腺癌中表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的臨床意義。

資料與方法

一、 EFNA2在癌癥中的表達(dá)分析

仙桃生物信息學(xué)工具(https://www.xiantao.love/products)是一個(gè)基于R語(yǔ)言的在線可視化的生物信息學(xué)分析工具，可以分析The Cancer Genome Atlas(TCGA)和Genotype-Tissue Expression(GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)中的腫瘤樣本和正常樣本的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)[10]。我們首先對(duì)包括LUAD在內(nèi)的 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中33 種癌癥的EFNA2 mRNA 表達(dá)進(jìn)行了非配對(duì)分析，然后對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中 LUAD的EFNA2表達(dá)，進(jìn)行了腫瘤樣本及正常組織樣本配對(duì)分析。

二、臨床病理特征與EFNA2關(guān)系分析

使用R語(yǔ)言包分析基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUAD患者的EFNA2 mRNA表達(dá)水平和LUAD患者的性別、年齡、病理分期、腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、轉(zhuǎn)移情況等臨床信息。我們根據(jù)LUAD臨床病理特征作為變量，進(jìn)行EFNA2的表達(dá)的單因素分析。然后，進(jìn)行Logistic回歸分析以評(píng)估臨床病理學(xué)特征與EFNA2之間的關(guān)系。采用ROC曲線用于評(píng)估EFNA2診斷LUAD的敏感性和特異性。

三、 EFNA2預(yù)后意義分析

首先篩選TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中包含有,有效預(yù)后信息的LUAD患者的臨床信息，根據(jù)篩選LUAD所有患者的EFNA2 中位表達(dá)值將納入患者分別分為EFNA2高表達(dá)組及EFNA2低表達(dá)組，使用 Log-Rank 方法進(jìn)行分析兩組患者的總生存時(shí)間(Overall Survival,OS)。然后使用cox 回歸分析,分析LUAD 患者OS的最終危險(xiǎn)因素。多變量分析中的變量包括性別、年齡、pT分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、轉(zhuǎn)移、和EFNA2 表達(dá)。之后我們對(duì)我單位胸外科2017—2022年實(shí)施根治性手術(shù)的72例LUAD患者的臨床資料進(jìn)行回顧性。72例患者中男性41例，女性31例，平均年齡69.4歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為：所患者均接受根治性手術(shù)，且隨訪時(shí)間超過(guò)一個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)為：1)合并其它惡性腫瘤病史；2)術(shù)前接受新輔助治療。根據(jù)患者腫瘤組織的免疫組化的EFNA2的表達(dá)水平分為高表達(dá)組(抗原表達(dá)2+、3+)以及低表達(dá)組(抗原表達(dá)1+、-)，比較兩組患者的OS。該研究部分經(jīng)銅陵市倫理委員會(huì)審批(2022011)。

四、腫瘤免疫浸潤(rùn)和免疫檢查點(diǎn)的分析

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUAD所有患者的EFNA2 中位表達(dá)值將納入患者分別分為EFNA2高表達(dá)組及EFNA2低表達(dá)組，通過(guò)使用集成在 R語(yǔ)言 的免疫 deconv 包中的ssGSEA算法,研究 EFNA2 表達(dá)與各種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞豐度之間的相關(guān)性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19. 0軟件進(jìn)行分析。兩組測(cè)量樣本的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析評(píng)估EFNA2的影響因素。ROC曲線用于評(píng)估診斷的敏感性和特異性。多變量Cox回歸和Log Rank分析用于研究預(yù)后,Log Rank分析采用基于EFNA2 中位表達(dá)值分組法。P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LUAD中EFNA2的表達(dá)

基于從TCGA和GTEx獲得的數(shù)據(jù)的非配對(duì)分析結(jié)果證實(shí)，EFNA2在33個(gè)腫瘤中的表達(dá)方式是發(fā)散的，EFNA2在不同腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)詳見(jiàn)(圖1)。我們對(duì)594例LUAD患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行對(duì)比分析(圖2,3)，結(jié)果證實(shí)EFNA2在LUAD中的表達(dá)顯著。

圖1 EFNA2在不同腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)(***P<0.001， **P<0.010，*P<0.050)

圖2 EFNA2在594例LUAD患者腫瘤和鄰近正常樣本表達(dá)含量差異的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)

圖3 EFNA2在59對(duì) LUAD患者腫瘤和鄰近正常樣本表達(dá)含量差異的配對(duì)樣本t檢驗(yàn)

二、EFNA2表達(dá)與臨床病理學(xué)變量之間的關(guān)聯(lián)

我們使用ROC曲線分析了包括從TCGA和GTEx 獲得的862例LUAD以及正常肺組織中EFNA2，以評(píng)估 EFNA2 在 LUAD 診斷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EFNA2 表達(dá)量診斷 LUAD 的敏感性和特異性分別為0.777和0.807，曲線下面積AUC為 0.824 (95%CI: 0.800 - 0.849，圖4)。從TCGA 下載了535例具有有效臨床信息和 EFNA2 表達(dá)的 LUAD 病例的數(shù)據(jù)。Logistic分析發(fā)現(xiàn)pT分期(P=0.010)是EFNA2表達(dá)的最終影響因素(表1)。

圖4 ROC曲線驗(yàn)證EFNA2表達(dá)在 LUAD 診斷中的作用

表1 EFNA2表達(dá)與臨床病理學(xué)變量關(guān)系的Logistic回歸分析

三、LUAD患者EFNA2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

首先使用 R語(yǔ)言中的生存包，使用基于 EFNA2 中位數(shù)表達(dá)的 Log-Rank方法，分析 477 名具有有效預(yù)后信息的 LUAD 患者的 OS。結(jié)果表明 LUAD 中 EFNA2的低表達(dá)與良好的預(yù)后相關(guān)(P<0.001，圖5、6)。之后使用 cox 回歸分析來(lái)確定 LUAD 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多變量分析的變量包括性別、年齡、腫瘤pT分期、pN分期、轉(zhuǎn)移和EFNA2表達(dá)，結(jié)果顯示pT分期(P<0.001)、pN分期(P<0.001)和EFNA2 表達(dá)(P=0.030)是 OS 的最終影響因素(表 2)。

表2 LUAD患者預(yù)后的cox分析

在對(duì)我院72例LUAD患者的臨床資料進(jìn)行回顧性后發(fā)現(xiàn)，72例患者中EFNA2高表達(dá)組為51例(抗原表達(dá)2+、3+)，低表達(dá)組為21例(抗原表達(dá)1+、-)，低表達(dá)組患者的OS明顯優(yōu)于高表達(dá)組患者(P=0.032)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 EFNA2低表達(dá)組LUAD患者預(yù)后明顯優(yōu)于EFNA2高表達(dá)組

圖6 72例LUAD手術(shù)患者的OS分析

四、EFNA2表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

我們分析了 14個(gè)免疫浸潤(rùn)細(xì)胞豐度與 LUAD 中 EFNA2 表達(dá)之間的關(guān)系。根據(jù)EFNA2中位表達(dá)將594個(gè)LUAD樣本分為EFNA2高組和低組。然后，使用ssGSEA算法分析免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的豐度。結(jié)果顯示在EFNA2低表達(dá)組中T細(xì)胞(P<0.05)、肥大細(xì)胞(P<0.05)、中性粒細(xì)胞(P<0.01)、毒性細(xì)胞(P<0.05)和B細(xì)胞(P<0.01)的腫瘤浸潤(rùn)豐度明顯升高(圖7)。

圖7 EFNA2表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

討 論

目前國(guó)內(nèi)極少有在LUAD中關(guān)于EFNA2的研究報(bào)道。該基因編碼肝配蛋白家族的一個(gè)成員。該蛋白質(zhì)由信號(hào)序列、受體結(jié)合區(qū)、間隔區(qū)和疏水區(qū)組成。根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)和序列關(guān)系，肝配蛋白分為通過(guò)糖基磷脂酰肌醇鍵錨定在膜上的肝配蛋白-A (EFNA) 類和跨膜蛋白的肝配蛋白-B (EFNB) 類。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EFNA2的表達(dá)在多種惡性腫瘤呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，提示其可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中[11-15]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EFNA2表達(dá)水平的變化與 LUAD 的預(yù)后有明顯的相關(guān)性。LUAD患者中上調(diào)的 TTC21A 表達(dá)是不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。同時(shí)，EFNA2表達(dá)水平與LUAD患者的pT分期有明顯正相關(guān)性。此外，這項(xiàng)研究表明，多種免疫細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平與 LUAD 中的EFNA2表達(dá)水平相關(guān)。因此，本研究的結(jié)果表明，EFNA2可能對(duì)腫瘤免疫學(xué)有潛在影響，并可能作為一種有效的預(yù)后及免疫治療標(biāo)志物。

我們研究中另一個(gè)值得注意的結(jié)論是關(guān)于 EFNA2表達(dá)與 LUAD 中免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性，ssGSEA 分析表明 TTC21A 表達(dá)與EFNA2中T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、毒性細(xì)胞和B細(xì)胞的浸潤(rùn)水平有顯著的負(fù)相關(guān)性。這一結(jié)果提示了EFNA2可能在調(diào)節(jié)LUAD腫瘤免疫微環(huán)境中的可能存在著重要意義。腫瘤組織除腫瘤細(xì)胞外，包括相關(guān)免疫細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，亦是其重要組成部分。這些細(xì)胞分泌各種因子影響腫瘤外的微環(huán)境，調(diào)控腫瘤行為[15-16]。現(xiàn)有的研究認(rèn)為腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度，是影響腫瘤生物特性的一個(gè)重要因素，其豐度水平往往與患者預(yù)后及惡性程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性[17-18]。亦可能是本研究中EFNA2低表達(dá)組LUAD患者預(yù)后優(yōu)于高表達(dá)組患者的一個(gè)合理解釋。

本研究的局限性在于我們的研究結(jié)果主要基于對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析和一部分組織樣本的免疫組化研究，可能無(wú)法完全揭示EFNA2在LUAD中的潛在生物學(xué)機(jī)制。但不可否認(rèn)的是，我們的研究結(jié)果證實(shí)EFNA2表達(dá)上調(diào)與LUAD的不良預(yù)后和免疫浸潤(rùn)有明顯的相關(guān)性。隨著對(duì)其功能有更深入的研究，EFNA2可能用作LUAD預(yù)后生物標(biāo)志物和免疫治療的潛在靶點(diǎn)。