SHH/Twist1對低氧誘導肺動脈高壓中內皮間質轉化過程的作用機制研究

劉蕾 馬德賓 史亮 孫文武

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺動脈平均壓漸進性升高為特征，導致患者右心衰竭及死亡的慢性疾病[1-2]。內皮功能障礙是PAH血管重塑的根源，尚無有效藥物可以逆轉廣泛血管重構及隨后引起的肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)升高[3]。內皮-間質轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)導致肺動脈增厚，對PAH中的肺動脈重塑起了很大作用，但其具體機制仍然有待進一步探討[4-5]。研究發現缺氧環境肺動脈內皮細胞中存在Sonic Hedgehog(SHH)通路水平上調[6]，而其主要效應因子glioma-associated oncogene-1(Gli1)能夠促進Twist-related protein 1(Twist1)的表達，后者轉錄激活是促進內皮向間充質轉化的關鍵因子[7]。因此，本課題計劃利用低氧誘導的肺動脈內皮細胞模型探討SHH/Gli是否通過調控Twist1水平影響EndMT過程，為PAH臨床治療探索新的靶點和思路。

資料與方法

一、 材料

內皮細胞專用培養基購自中喬新舟(中國)，Cyclopamine購自源葉生物(中國)，脂質體3000購自invitrogen(美國)，結晶紫購自Amresco(美國)，Transwell小室購自Corning(美國)，BeyoRT II M-MLV反轉錄酶購自碧云天(上海)，TRIpure購自BioTek(北京),2×Taq PCR MasterMix購自Solarbio(北京)，Twist siRNA及對照由金拓思(武漢)合成，兔抗SHH抗體購自abclonal(中國)，兔抗Gli1抗體購自Affinity(中國)，兔抗Twist1抗體、兔抗 β-actin抗體及羊抗兔IgG-HRP購自萬類生物(中國)，引物委托金斯瑞(南京)合成，其他試劑為國產分析純。

二、 大鼠肺動脈內皮細胞原代分離培養

200～300 g雄性SD大鼠麻醉后取出心肺組織，顯微鏡下剝離各級肺動脈及周圍結締組織，將肺動脈剪開，在含PBS的10 cm的培養皿中，反復清洗血管內的血液，用無菌刀片將組織片切成1～2 mm2大小的動脈片，移入直徑為35 mm的培養皿中，以其內膜面貼于培養皿，置細胞培養箱干涸2 h后，加入3 mL專用培養基于37℃，5%CO2的培養箱內培養。72 h后細胞可達一定密度，將動脈片去除，換液一次。每2 d換液一次，每次按照新鮮培養基1 ∶1進行換液，繼續培養7 d，細胞融合成單層。密度達到90%，用胰蛋白酶消化，進行傳代培養。

三、 細胞處理及分組

將分離得到的大鼠肺動脈內皮細胞胰酶消化計數后重新接種細胞培養板，隨機分為正常對照組、模型組、模型+SHH抑制劑組、模型+siNC、模型+Twist siRNA組；待細胞融合超過50%后，模型組細胞按照實驗分組，分別加入干預藥物或轉染試劑，其中模型+SHH抑制劑組細胞，更換含有5 μM Cyclopamine的培養基，模型+siNC及模型+Twist siRNA組分別將siNC/Twist siRNA與脂質體混合后逐滴加入各細胞培養孔中，瞬時轉染細胞，37℃、5%CO2培養過夜后，將細胞置于3% O2條件下培養3～7 d，建立PAH誘導干預模型，正常對照組細胞保持正常培養條件，顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

四、 CCK8檢測細胞增殖能力

細胞接種于96孔培養板中，每孔細胞量為3×103個，每組設計5個復孔，按照實驗分組進行細胞處理后，分別培養24 h、48 h、72 h，每孔加入10μl CCK-8，37 ℃，5%CO2的培養箱內培養2 h，在酶標儀上測定其在450 nm處OD值，進行數據分析。

五、 Transwell細胞遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10% FBS的培養液800 μl；胰酶消化各組細胞，取細胞懸液200 μl加入Transwell上室，細胞數均為3×104個/孔，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養24 h，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，0.5%結晶紫染液染色5 min后清洗，在倒置顯微鏡下(200×)對遷移至微孔膜下層的細胞計數，每個樣本選取5個視野計數細胞個數，取均數。

六、 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達

收集各組細胞樣品，分別加入1 mL TRIpure 裂解液，Trizol法提取總RNA，檢測濃度并調整使之均一化，參照反轉錄酶操作說明進行反應合成cDNA，以β-actin為內參基因，擴增VE-cadherin、Vimentin基因，2-△△ CT方法分析檢測結果。引物信息如下，VE-cadherin引物序列：上游5′-CGACGCTTCTACCACTTC-3′，下游5′-TGTTCCCTTGTTTGGTTATT-3′，擴增產物為160 bp；Vimentin引物序列：上游5′-CGCCAGATGCGTGAAATG-3′，下游5′-GAGGAAGTGACTCCAGGTTAG-3′，擴增產物為274 bp；β-actin引物序列：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′，擴增產物為155 bp。

七、 Western blot檢測蛋白表達

收集各組細胞樣本，參照試劑盒說明裂解抽提蛋白，BCA法測定蛋白濃度并調平后，取20 μl蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜，洗膜后加入一抗(Twist1 1 ∶500，SHH 1 ∶400，Gli1 1 ∶1000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液重復洗膜4次，加入HRP標記的二抗于37℃孵育45 min(1 ∶5000稀釋)，TBST再次洗膜6次，加入ECL發光液靜止反應約5 min，暗室中曝光，以β-actin為內參，進行圖像采集及灰度分析，分別對Twist1、SHH、Gli1抗體表達進行半定量分析。

八、 統計分析

結 果

一、 各組細胞形態學觀察

經低氧條件培養7 d后，對照組細胞多呈鵝卵石鑲嵌狀排列，多角形或梭形，大小均勻，相互融合；模型組細胞呈梭形生長，細胞間界限分明，細胞增殖較快； SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組，細胞形態及數量介于前兩組之間(見圖1)。

圖1 光鏡下觀察低氧處理7d后各組細胞形態變化(×100鏡下觀察)

二、 各組細胞增殖能力變化

CCK8結果顯示(見圖2)，與對照組比較，24 h后模型組細胞增殖能力有所升高，但無顯著差異，48 h及72 h時間點顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，48 h及72 h時間點SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組細胞增殖能力顯著下調(P<0.05)。

圖2 CCK8檢測細胞增殖情況(*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組)

三、 各組細胞遷移能力變化

Transwell檢測結果顯示(見圖3)，與對照組比較，模型組細胞遷移能力顯著增強(P<0.05)，與模型組比較，SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組細胞遷移能力有所降低(P<0.05)。

圖3 Transwell檢測細胞遷移能力變化(A：結晶紫染色，×200鏡下觀察；B：各組細胞遷移個數比較，*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組)

四、各組細胞VE-cadherin及Vimentin mRNA表達情況

實時定量PCR結果顯示(見圖4)，與對照組比較，模型組中VE-cadherin表達顯著降低，Vimentin水平顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組VE-cadherin指標表達均顯著上調，Vimentin水平顯著降低(P<0.05)。

圖4 實時定量PCR檢測VE-cadherin及Vimentin mRNA表達情況

五、 各組細胞SHH、Gil1以及Twist1蛋白表達情況

Westernblot檢測結果顯示(見圖5)，與對照組比較，模型組中SHH、Gil1以及Twist1蛋白水平均顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組中SHH、Gil1及Twist1水平明顯降低(P<0.05)。

圖5 Westernblot檢測SHH、Gil1以及Twist1蛋白水平變化情況(*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組)

討 論

肺動脈高壓(PAH)的是一種肺小動脈原發性病變，特征在于肺動脈的一系列結構變化，如內膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化等[8]。最近多項研究表明，內皮間質轉化(EndMT)在PAH患者和動物模型中均有發生[5, 9]。EndMT指在缺氧、炎癥等刺激因素持續影響下，內皮細胞向間質細胞轉變的過程，EndMT過程中，內皮細胞失去極性及細胞間接觸，并經歷細胞骨架重塑，是內皮功能障礙的一個復雜事件，被認為是上皮-間充質轉變(epithelial-mesen-chymal transition，EMT)的一種特殊形式，與肺動脈高壓的發生和進展密切相關[3]。Hh信號通路在胚胎發育中起關鍵作用，研究發現，Hh通路能夠通過非配體依賴途徑，調控缺氧誘導的腫瘤細胞 EMT 及侵襲過程。Gli-1是Hh信號傳導的主要效應因子，可降低E-cadherin的水平，增加Vimentin的水平，這提示Hh信號對于EMT的發生非常重要[10]。SHH是Hedgehog的同源基因，研究發現，在PAH患者肺組織中存在SHH表達上調[6]。越來越多的研究表明SHH信號通路通過調節EMT變化在腫瘤細胞中發揮影響作用，Perez等也指出EndMT與EMT過程共享許多分子調控機制[11-12]。在本研究中，我們通過體外實驗，首次驗證了SHH/Gli通路在缺氧誘導PAH的EndMT中的重要影響，SHH/Gli1上調，通過調控Twist1水平介導肺動脈內皮細胞EndMT過程，抑制SHH活性或干擾Twist1均能抑制內皮細胞向間質轉化，可能對緩解PAH進展中內皮功能障礙具有一定的調控作用。

為了建立PAH細胞模型，我們分離培養了大鼠原代肺動脈內皮細胞，并給予低氧環境誘導。CCK-8及Transwell檢測結果顯示與正常細胞比較，缺氧誘導后肺動脈內皮細胞增殖、遷移能力顯著增加；細胞形態觀察也顯示，缺氧誘導環境下內皮細胞形態向間質表型轉化。PAH中的EndMT細胞具有顯著增殖活性，是炎癥應激與內皮功能障礙之間復雜相互作用的關鍵環節[13]。EndMT在肺動脈重構中起著關鍵作用，在此過程中內皮細胞獲得間充質樣細胞的遷移能力，并入侵到肺動脈中膜[14]。也有研究指出SHH在氧化應激反應中發生上調，并與細胞增殖和動脈重塑有關[15-17]。而本研究中發現，經SHH抑制劑或Twist1 干擾處理后，模型組細胞增殖能力、遷移顯著降低(P<0.05)，且細胞形態變化發生逆轉。上述結果提示，在缺氧誘導的細胞PAH中存在SHH通路和Twist1的激活，并可能與EndMT過程轉變有關。

EndMT發展過程中內皮細胞失去內皮細胞表型及表面標記，而獲得間充質或平滑肌細胞表型，內皮細胞在形態上發生變化，內皮細胞基因和蛋白水平變化主要表現在原有的內皮標記物(VE-cadherin，CD31)減少，由VE-cadherin介導的細胞粘附喪失，間充質標記物(Vimentin)的表達水平增加，轉錄因子Twist1表達增加[5]。本研究中的實驗結果也驗證了這些表型的變化，實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照組比較，模型組細胞內皮細胞標志VE-cadherin表達顯著降低，間充質細胞標記Vimentin水平顯著上調(P<0.05)。EndMT受到多種信號通路調控，我們的目標著重關注SHH/Gil1信號通路在缺氧誘導的PAH中發揮的作用。蛋白水平檢測結果提示低氧誘導能夠顯著上調肺動脈內皮細胞中SHH、Gil1以及Twist1的表達水平(P<0.05)。SHH抑制劑作用及Twist1 沉默干預處理后，Western blot檢測結果驗證了模型組細胞中SHH/Gil1通路受到抑制以及Twist1蛋白水平下調，此外抑制Twist1表達后SHH/Gil1也受到抑制，提示Twist1可能對SHH通路存在反饋調節。與模型組比較，SHH抑制劑及Twist1 沉默干預后模型組細胞中VE-cadherin指標基因表達水平顯著上調，Vimentin水平顯著降低(P<0.05)；上述結果提示，抑制SHH通路可能通過影響Twist1水平調節低氧環境下肺動脈內皮細胞的EndMT轉化。

綜上所述，缺氧環境誘導SHH/Gli通路激活促進肺動脈內皮細胞增殖，加速細胞內皮向間質轉化，促進PAH病理進展，這可能與該通路介導Twist1水平升高有關，抑制SHH通路活性可以改善PAH過程中EndMT轉化進程，從而緩解缺氧性肺動脈高壓。目前，已開發的防治策略難以根治PAH，主要原因是PAH發生機制尚未明晰。本文為肺血管ECs異常增殖及間充質轉化在PAH進展中具體調節機制研究提供了新的視角及實驗證據，有助于為PAH臨床治療探索有效的干預措施及靶點，提供理論依據及實驗支持。