血清內皮功能標記物甲基化精氨酸與嬰幼兒喘息性疾病的相關性研究

張淑琴 易陽 張雯婷

喘息性疾病是嬰幼兒期常見的呼吸系統疾病，主要由毛細支氣管炎和哮喘組成。兒童毛細支氣管炎與哮喘有類似的免疫學基礎[1-4]，目前兩者在臨床上缺乏有效的生物學指標來預測和區分。兒童喘息類疾病，往往伴隨以氣道中炎癥因子分泌增加、氣道血管新生異常和重構為特征的血管內皮功能障礙[5]。不對稱二甲基精氨酸(ADMA)不但是內皮功能的經典風險因子，還是哮喘狀態下潛在的氣道標記物及新的治療靶標[6]，其同分異構體對稱二甲基精氨酸(SDMA)可競爭性與陽離子氨基酸轉運體(CATs)競爭，抑制L-精氨酸的攝取，從而造成血管內皮損傷[7]。目前，有關精氨酸甲基化與嬰幼兒期喘息類疾病的病理生理關聯尚不明確。本文擬通過考察嬰幼兒喘息性疾病血清中ADMA和SDMA的水平對此進行探索。

資料與方法

一、一般資料

所有病例來源于本院呼吸科住院部或門診，正常健康兒童為對照組。共納入對照組18例，男9例，年齡3～12月，平均年齡7.17±2.66月；肺炎組22例，男12例，年齡2～17月，平均年齡6.72±4.21月；毛支組18例，男10例，年齡2～16月，平均年齡5.50±2.77月；哮喘組16例，男9例，年齡9～22月，平均年齡14.43±3.78月。各組男女比例均無統計學顯著差異，對照組、肺炎組、毛支組年齡無顯著差異，哮喘組平均年齡大于其他三組(P<0.001)。對毛支組和哮喘組進行為期1年的跟蹤隨訪，記錄一年之內喘息、咳嗽(使用支氣管擴張劑改善)次數，以此為主要的預后指標。

5歲以下兒童哮喘的診斷標準[8]：分別為：(1)喘息累計發作頻率≥4次；(2)存在可逆性氣流受限(包括霧化吸入SABA 治療有效，或經4～8 周ICS 抗哮喘治療有效)；(3)個人過敏史；(4)一級親屬過敏史；(5)體內外變應原檢測陽性。 根據各參數的相關強度分別賦予“3-3-1-1-1”，累計分數達到4分以上診斷為哮喘。本研究經常州市兒童醫院倫理委員會同意(常兒醫倫理審查(科研)2016-004)，且征得參與者家屬知情同意。

二、方法

血清ADMA、SDMA和L-精氨酸的檢測方法：所有參與者于入院時留取全血樣本，3500rpm×10 min離心后儲藏于-80℃冰箱中待用。血清中ADMA、SDMA和L-精氨酸用此前建立的基于柱前衍生化-高效液相色譜(HPLC)分離-串聯質譜(MS/MS)檢測的方法進行檢測[9]。

主要儀器與裝置：Finnigan TSQ-4000 TSQ Quantum Access液相質譜聯用系統(Thermo Fisher, USA)，配有LC-20AD液相色譜泵，DGU-20A3在線脫氣機， SIL-20AC自動進樣器，ESI接口離子源，Xcalibur色譜工作站。超純水機：(Milli-Q A10, USA)；高速冷凍離心機(Eppendorf 5430R，德國)。主要試劑：ADMA、SDMA，L-精氨酸和內標高精氨酸標準對照品購自Sigma公司(美國)。

血清樣品前處理：血清于室溫解凍后以超純水以1 ∶3稀釋后內標homo-精氨酸溶液(500 μM)，加入乙腈混勻3 min以充分沉淀蛋白后以15000g進行10 min離心。上清于80℃水浴中空氣吹干后加入以4:1的比例加入1 mol/L鹽酸正丁醇作為柱前衍生化試劑，然后以65℃水浴溫孵15 min。此后揮干衍生化試劑，后以100 μL超純水復溶樣品，15000g×10 min離心兩次，取5 μL進樣。

色譜條件：島津5.0 μm ODS C18色譜柱(日本)，柱溫：40℃；流動相A：甲醇；B：醋酸銨水溶液(10 mM, pH4.0)。梯度洗脫條件： 0～3 min, 18% A; 3～3.1 min, 18%～60% A; 3.1～5.5 min, 60% A; 5.5～5.6 min, 60～18% A。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細管溫度：380℃；電離電壓：4.5kV；霧化氣和氣簾氣：氮氣，30 L/min；輔助氣：氮氣，10 L/min；監測模式：SRM；掃描方式：正離子掃描。母離子/子離子：ADMA, 259/214, 20 eV; SDMA, 259/228, 20 eV; L-精氨酸, 231/70, 20 eV; homo-精氨酸, 245/84, 15 eV。

三、統計學分析

結 果

一、對照組、肺炎組、細支氣管炎組、哮喘組血清精氨酸甲基化代謝物濃度(見表1)。

表1 對照組、肺炎組、毛支組和哮喘組血清L-精氨酸、ADMA、SDMA比較

二、毛細支氣管炎和哮喘隨訪情況

共34例，12例失訪，22例隨訪成功，隨訪成功率64.7%。通過1年隨訪結果顯示，1年內出現至少1次反復咳嗽或喘息的哮喘和毛細支氣管炎參與者(隨訪B組，n=7)急性期血清ADMA水平顯著高于隨訪中沒有出現反復咳嗽或喘息的參與者(隨訪A組，n=15)血清中的水平(0.74±0.14 μMvs0.58±0.14 μM,P<0.05)， ROC分析AUC=0.829 (0.649～1.008)，P<0.05；兩組SDMA水平沒有顯著差別，同時ROC曲線AUC=0.619(0.300～0.939),P>0.05。該結果表明，嬰幼兒毛細支氣管炎和哮喘急性發作期血清ADMA水平的增高與后期發生反復咳嗽或喘息有顯著相關性，ADMA是預測反復喘息的生物標志物(見圖1)。

圖1 A組：1年隨訪期內未出現反復咳嗽或喘息；B組：1年隨訪期內至少出現1次反復咳嗽或喘息注：*：隨訪B組急性期血清ADMA水平顯著高于隨訪A組(0.74±0.14 μM vs 0.58±0.14 μM), P<0.05

討 論

哮喘為慢性氣道炎癥，精氨酸甲基化產物ADMA與氣道炎癥和高反應性有關[10]。ADMA是全身蛋白質周轉的一種代謝物，主要來源于氣道上皮[11]，是NOS的內源性競爭抑制劑, 對NOS的三種亞型eNOS、nNOS和iNOS均有顯著的抑制作用，是NO平衡的一個重要因素。動物實驗證明外源性ADMA可引起氣道高反應性，增加膠原蛋白的形成，并誘發小鼠的可逆性纖維化[12]。另有研究表明較高的ADMA對NO的平衡有不利影響，氣道阻力和ADMA之間呈正相關，可導致哮喘的不良后果[13]。Th2細胞因子IL-4能顯著下調支氣管上皮細胞中二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(DDAH2)水平，使ADMA的降解代謝下降而造成ADMA的大量累積，以及由此產生缺氧應激導致氣道上皮細胞線粒體丟失[14]。因此，ADMA水平與哮喘有密切相關性，但是在嬰幼兒中的研究相對較少。

在哮喘和COPD等慢性氣道疾病中，精氨酸酶表達升高會導致氣道收縮、高反應、炎癥及重塑等一系列反應。精氨酸酶和NOS表達水平及其活性的改變，在哮喘或COPD等各種氣道疾病的發展中起著核心作用[15]。研究顯示，哮喘急性發作病人線粒體功能障礙與血漿內源性ADMA 濃度升高密切相關。 ADMA導致線粒體功能障礙可能與NO生成減少，氧化應激增加，線粒體生物合成受到抑制有關[16]。哮喘和毛細支氣管炎是嬰幼兒最常見的喘息性疾病，兩者發病機制相似[17]，具有高度的異質性，80%以上的哮喘起始于嬰幼兒階段，臨床對嬰幼兒喘息性疾病進行早期識別、評估和管理仍極具挑戰性，臨床仍缺乏生物學指標來預測。

本研究表明，嬰幼兒哮喘急性期血清ADMA濃度較對照組、肺炎組增高，與毛細支氣管炎沒有明顯差異(P=0.094)。研究表明，在病毒和細菌感染后不久，肺部巨噬細胞和多形核白細胞中iNOS上調，導致NO生產、NO代謝物和ADMA水平增加[18]，NO已被證明可抑制人類Th17細胞的增殖[19]。在哮喘病人中，已經觀察到局部和全身的iNOS、精氨酸酶、ADMA和精氨酸水平與肺功能和哮喘的嚴重程度有關[9，20]。哮喘患者[21]和不同的過敏性哮喘動物模型[22]的基因關聯研究表明，精氨酸酶在疾病的不同方面發揮著關鍵作用。較高的精氨酸水平和精氨酸/ADMA比值，都與較低的CCL-20和TNF-α有關[23]，CCL-20是CCR6的配體，通過免疫細胞增強Th17介導的炎[24],補充精氨酸可通過誘導精氨酸酶的活性抑制TNF-α的合成[25]，本研究中AMI在毛細支氣管炎組和哮喘組高于正常對照組，提示其免疫炎性反應的異常，可能是炎性反應的生物學標記物。盡管本研究中哮喘組兒童平均年齡高于其他組，但考慮ADMA隨著年齡血清濃度是下降的[26]，如去除年齡影響因素，更具有統計學差異。隨訪一年中發現，毛細支氣管炎和哮喘患者中，發生至少1次反復咳嗽或喘息者其血清中的ADMA水平顯著高于未發生反復咳嗽或喘息者，ROC分析AUC=0.829 (0.649～1.008)，(P<0.05)，表明血清ADMA是該群體中預測發生喘息的標記物。

本研究發現，肺炎、毛細支氣管炎和哮喘嬰幼兒血清SDMA均明顯高于正常組(P<0.001)，但組間沒有差異。盡管SDMA間接影響NO水平，但與ADMA相比影響較少。研究表明高SDMA水平與ICU中收治的危重癥患者的短期和長期死亡率有關，其中敗血癥患者SDMA水平最高，提示SDMA可能與感染相關[27]。本研究中沒有納入重癥病例，SDMA是否參與嬰幼兒呼吸道感染這一共同的病理進程尚證據不足。

綜上，精氨酸甲基化過程參與嬰幼兒喘息類疾病的生理病理進程，ADMA可能是嬰幼兒哮喘的生物學記物，毛細支氣管炎和哮喘急性期血清ADMA水平升高可能是其發生反復咳嗽或喘息的預測標記物，但其特異性和敏感性需更多的試驗進一步探索。在本研究中樣本數偏少，失訪率較高，隨訪時間較短，在以后中需加大樣本量進一步研究。