八寶丹抑制TNF-α誘導C2C12成肌細胞Atrogin-1表達的研究

趙棋琴，陳進曉，沃 達，何 嘉，彭 軍，3，朱偉東，任丹妮，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州 350122；2.福建中醫藥大學科技創新與轉化中心，福建福州 350122；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122）

癌癥是全球主要死因之一［1］，50%的晚期癌癥患者都患有癌癥惡病質［2］，癌癥惡病質是癌癥患者死亡的主要原因［3］。骨骼肌萎縮是癌癥惡病質最主要的臨床表現，其與患者器官功能障礙、生活質量降低以及抗癌治療的耐受性和療效性降低相關［4］。目前缺乏治療肌肉萎縮的有效藥物，所以迫切需要研發新的藥物［5］。炎癥是骨骼肌萎縮的主要原因，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的肌肉萎縮誘導因子［6］，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路作為經典炎癥信號通路，是炎癥因子誘導肌肉萎縮的一個重要步驟［7-8］，NF-κB 信號通路可被炎癥因子TNF-α激活，導致肌肉蛋白降解主要信號通路——泛素蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）的關鍵組分泛素連接酶表達過度上調，最終使UPS 系統處于高度應激狀態［9-10］，肌肉蛋白降解增多［11］。萎縮相關基因1（atrophy gene 1，Atrogin-1）是一種泛素連接酶，在骨骼肌中特異性表達，其過度表達會導致肌肉蛋白降解增多［12-13］。八寶丹（Babaodan，BBD）為我國經典復方，臨床實踐證明BBD 作為多種晚期癌癥輔助用藥可提高患者生活質量，緩解化療出現的不良反應［14］，由此可見BBD 可以緩解晚期癌癥患者出現的不良狀態，但目前尚無BBD 治療癌癥惡病質肌肉萎縮的相關研究。故本課題擬通過體外實驗探討BBD 對TNF-α 誘導的NF-κB 信號通路及下游通路UPS 系統中Atrogin-1 表達的作用機制研究，為BBD 抑制肌蛋白降解相關通路提供了體外實驗數據，也為治療癌癥惡病質提供新的治療思路。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 C2C12 成肌細胞購于中國科學院細胞庫（目錄號：SCSP-505）。

1.2 實驗藥物 BBD 購自廈門中藥廠股份有限公司（批號：190530）。

1.3 實驗試劑 p-P65 抗體、p-IκB 抗體（美國CST公司，貨號：3033T、2859S）；GAPDH 抗體（美國Proteintech 公司，貨號：60004-1-Ig）；Atrogin-1 抗體（英國Abcam 公司，貨號：ab168372）；Goat-anti-Mouse-IgG、Goat-anti-Rabbit-IgG（美國Signaling Antibody公司，貨號：L3032、L3012）；DMEM 不完全高糖培養液（江蘇凱基生物技術有限公司，貨號：KGM12800 N-500）；胎牛血清（PEAK Serum 公司，貨號：S-FBSSA-015）；青霉素和鏈霉素混合液、0.4%臺盼藍染液、NP-40 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：SV30010、C0040、N8032）；1×PBS 緩沖液（南京維森特生物技術有限公司，貨號：311-010-CL）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司，貨號：25200072）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0197）；MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0009S）；蛋白酶抑制劑Cocktail、磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅰ、磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅱ（MCE公司，貨號：HY-K0010，HY-K0021、HYK0022）；SuperKineTM超敏型ECL 發光液（Abbkine 公司，貨號：BMU102-CN）；TNF-α 蛋白液（美國R&D Systems 公司，貨號：410-MT）。

1.4 實驗儀器 CO2培養箱（美國Thermo Fisher 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；Countstar 全自動細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；多功能酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；干式恒溫金屬浴（上海培青科技有限公司）；SDS-PAGE 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；Trans-Blot 小型轉膜槽轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；旋轉搖床（中國江蘇其林貝爾儀器有限公司）；超高靈敏化學發光系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法與結果

2.1 BBD藥液制備 稱取25 mg BBD溶于1 mL PBS緩沖液，制備成25 mg/mL BBD 藥液，儲存于-20 ℃冰箱中。

2.2 細胞培養 將C2C12 成肌細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 不完全高糖培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞匯合度至70%～80%進行后續實驗。

2.3 統計學方法 采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，2 組比較采用獨立樣本t 檢驗。

2.4 MTT 法篩選BBD 干預細胞濃度 將C2C12 成肌細胞以3×103個/100 μL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，待各組細胞匯合度至70%～80%，棄上清液，分別予0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL BBD 藥液干預48 h，每種濃度6 個復孔，48 h 后棄上清液，每孔加入濃度為0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，培養箱內繼續孵育4 h，每孔再加入100 μL Formazan 溶解液，適當混勻，使用酶標儀在570 nm 處測吸光度，根據公式計算細胞活力。

MTT 法實驗結果顯示，不同濃度BBD 對C2C12成肌細胞活力無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。結合本課題組前期研究結果，最終選用0.75 mg/mL作為后續實驗BBD的干預濃度［15］。

圖1 不同濃度BBD 對C2C12 細胞活力的影響

2.5 篩選TNF-α 上調p-P65 蛋白表達的濃度和時間 按3×105個/mL 的細胞密度，將對數生長期C2C12 成肌細胞接種于35 mm2培養皿中，待細胞匯合度至70%～80%，分別加入0、1、10、50 ng/mL TNF-α 蛋白液干預C2C12 成肌細胞8 min。NP-40裂解液提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量，細胞總蛋白中加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（還原性，5×），再將其置于100 ℃干式恒溫金屬浴變性。20～30 μL 蛋白樣本經聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳完全分離后，TBST 洗膜3 次，通過濕轉法將蛋白轉至PVDF 膜上，TBST 洗膜3 次，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST 洗膜，抗體p-P65（1∶1 000），GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，隨后TBST洗膜3 次，加Goat-anti-Mouse-IgG 或Goat-anti-Rabbit-IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，使用SuperKine?超敏型ECL 發光液顯色，將GAPDH作為總蛋白內參，運用Image J 軟件分析各目的蛋白的灰度值，比較不同TNF-α 濃度對p-P65 蛋白相對表達量的影響，結果見圖2。與0 ng/mL 比較，10、50 ng/mL TNF-α 分別刺激細胞后，p-P65 蛋白表達均明顯上調（P＜0.05），最終選取TNF-α 刺激濃度為10 ng/mL。

再篩選TNF-α 上調p-P65 蛋白表達的最佳時間，按3×105個/mL 的細胞密度，將對數生長期C2C12 成肌細胞接種于35 mm2培養皿中，10 ng/mL TNF-α 蛋白液分別在8 min、15 min、30 min、1 h 刺激細胞，提取細胞總蛋白及Western blot 法操作同前，結果見圖3，10 ng/mL TNF-α 刺激細胞8 min 顯著上調p-P65蛋白表達（P＜0.05），最終選取10 ng/mL TNF-α 刺激細胞8 min 作為后續實驗干預濃度和時間。

圖2 不同TNF-α 濃度對p-P65 蛋白表達的影響

圖3 不同TNF-α 刺激時間對p-P65 蛋白表達的影響

2.6 篩選TNF-α 上調Atrogin-1 蛋白表達的濃度和時間 Atrogin-1 為NF-κB 信號通路下游通路指標，對TNF-α 蛋白反應時間不同，因此再篩選TNF-α 上調Atrogin-1 蛋白表達的濃度和時間。取對數生長期C2C12 成肌細胞按3×105個/mL 的細胞密度接種于35 mm2培養皿中，待細胞匯合度至70%～80%，分別加入0、1、10、50 ng/mL TNF-α 蛋白液干預C2C12 成肌細胞4 h，Western blot 法步驟同前，Atrogin-1 和GAPDH 抗體稀釋比例分別為1∶1 000 和1∶5 000，結果見圖4。與0 ng/mL 比較，1、10、50 ng/mL TNF-α 刺激細胞后，Atrogin-1 蛋白表達明顯上調（P＜0.05），為與前刺激濃度一致，最終選取TNF-α 刺激濃度為10 ng/mL。

圖4 不同TNF-α 濃度對Atrogin-1 蛋白表達的影響

再篩選TNF-α 上調Atrogin-1 蛋白表達的最佳時間，將對數生長期C2C12成肌細胞按3×105個/mL的細胞密度接種于35 mm2培養皿中，10 ng/mL TNF-α 蛋白液分別在8 min、15 min、30 min、1 h、4 h刺激細胞，Western blot 法操作同前，結果見圖5。10 ng/mL TNF-α 刺激細胞4 h 顯著上調Atrogin-1蛋白表達（P＜0.05），最終選取10 ng/mL TNF-α 刺激細胞4 h作為后續實驗干預濃度和時間。

圖5 不同TNF-α 刺激時間對Atrogin-1 蛋白表達的影響

2.7 BBD 對p-P65、Atrogin-1 蛋白表達的作用 按3×105個/mL 的細胞密度，取對數生長期C2C12 成肌細胞接種于35 mm2培養皿中，設置空白對照組，藥物對照組、模型組、八寶丹組，待細胞匯合度達到70%～80%，藥物對照組和八寶丹組加入0.75 mg/mL BBD 藥液，同時空白對照組和模型組加入等體積PBS，預處理2 h。①模型組和八寶丹組加入10 ng/mL TNF-α 蛋白液，與此同時空白對照組和藥物對照組加入等體積PBS，刺激細胞8 min 后，冰PBS 收取細胞，與上述提取細胞總蛋白及Western blot 法步驟一致，檢測各組p-P65 蛋白表達；②模型組和八寶

圖6 4 組C2C12 成肌細胞p-P65 蛋白表達比較

3 討 論

肌肉萎縮是癌癥惡病質患者死亡的預測因子［16］，在癌癥惡病質的動物模型中，肌肉萎縮得到改善的動物模型病死率降低［17］，表明改善肌肉萎縮可能有助于提高惡病質患者生存率。成肌細胞是體外研究肌肉生長修復重要的細胞系，目前用于實驗研究的成肌細胞主要是C2C12 成肌細胞［18］。因此本研究選用C2C12 成肌細胞作為研究對象。炎癥是肌肉萎縮的常見觸發因素，炎癥因子是肌肉萎縮的有效誘導劑，TNF-α 已被證明對骨骼肌有分解代謝作用［19］，主要是通過激活NF-κB 信號通路［7］，TNF-α 通過結合并激活其同源受體TNF-αR后，促使IKKα 磷酸化IκBα 而被降解，NF-κB-IκB二聚體解離，NF-κB p65 亞單位上的S536 發生磷酸化，使得NF-κB 入核調控下游基因表達，從而導致丹組加入10 ng/mL TNF-α 蛋白液，同時空白對照組和藥物對照組加入等體積PBS，刺激細胞4 h 后，冰PBS 收取細胞，與上述提取細胞總蛋白及Western blot 法步驟一致，檢測各組Atrogin-1 蛋白表達。

圖7 4 組C2C12 成肌細胞Atrogin-1 蛋白表達比較

圖6 結果顯示，與空白對照組比較，模型組p-P65 蛋白表達顯著上調（P＜0.01），而與模型組比較，八寶丹組p-P65 蛋白表達顯著下調（P＜0.01）。圖7 結果顯示，與空白對照組比較，模型組Atrogin-1蛋白表達顯著上調（P＜0.05），而與模型組比較，八寶丹組Atrogin-1 蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。UPS 中泛素連接酶如Atrogin-1 過度上調，肌肉蛋白質降解增多［9］。故選取TNF-α 蛋白液刺激C2C12成肌細胞模擬體內炎癥引起的肌肉萎縮模型，因p-P65 及下游通路指標Atrogin-1 在不同時間點對TNF-α 反應時間不一致，故分別篩選TNF-α 上調p-P65、Atrogin-1 表達的最佳濃度和時間。結果表明10 ng/mL TNF-α 刺激細胞8 min 顯著上調p-P65蛋白表達，而10 ng/mL TNF-α 刺激細胞4 h 顯著上調Atrogin-1 蛋白表達。

癌癥惡病質歸為中醫“虛勞”范疇［20］，治療原則為扶正固本、化痰祛濕、活血化瘀解毒以助癌毒消散［21］。BBD 由牛黃、蛇膽、羚羊角、麝香、珍珠、三七和兩種保密藥物組成，功效為清利濕熱、活血解毒、通經止痛，其功效基本符合中醫對癌癥惡病質的治療原則［14］。本研究發現，BBD 可抑制TNF-α誘導的NF-κB 信號通路中NF-κB 的磷酸化水平及下游通路Atrogin-1 蛋白表達，表明BBD 可能通過抑制NF-κB 通路的激活進而削弱UPS 系統的活性，減少肌肉蛋白降解量。本研究為有效防治癌癥惡病質肌肉萎縮提供了研究基礎，但BBD 對癌癥惡病質肌肉萎縮動物模型的作用有待進一步研究探討。