訶子對大鼠血清代謝產(chǎn)物的影響研究*

畢力格，烏日漢，麗 麗，陳玉花，孟香花，寶樂爾，韓曉靜，肖田梅，白梅榮

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果實(shí)。秋、冬二季果實(shí)成熟時采收。蒙古名為阿茹日，異名為額莫音·芒來、浩日音·達(dá)日嘎，味澀，性平，具有調(diào)節(jié)赫依、希日、巴達(dá)干失調(diào)，解毒，調(diào)元等功能。主治赫依病，希日病，巴達(dá)干病，赫依、希日、巴達(dá)干合并癥和聚合癥，各種毒癥等[1]。現(xiàn)代研究證明，訶子還有止瀉、收斂降火、利咽等功效，主治瀉久痢、便血脫肛、肺虛喘咳、咽痛、音啞等癥狀[2-3]。在蒙藥藥性理論的指導(dǎo)下，訶子主要用與中毒解救和調(diào)元，在98%的常用含有毒藥味的蒙藥復(fù)方中訶子均發(fā)揮著解毒和調(diào)元作用，兩千多年的蒙醫(yī)臨床實(shí)踐也證明了復(fù)方組成的合理性和可行性。因此，訶子被譽(yù)為“藥中之王”和“鎮(zhèn)毒之王”的美名。目前對訶子的研究主要集中于訶子化學(xué)成分、現(xiàn)代藥理作用及基于代謝組學(xué)的腦損傷保護(hù)機(jī)制及草烏解毒機(jī)制等研究，但未見訶子單味藥代謝組學(xué)的研究報道。因此，本研究用LC-MS技術(shù)，分析蒙藥訶子對大鼠小分子代謝物的改變情況，為探討訶子調(diào)節(jié)赫依、希日、巴達(dá)干失調(diào)，解毒和調(diào)元功效的現(xiàn)代化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠，SPF級，體重為(200±20)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供(SCXK(遼)2015-0001)。

1.2 藥品與試劑 實(shí)驗(yàn)用訶子藥材是使君子科植物訶子成熟果實(shí)，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，由蒙醫(yī)藥學(xué)院包桂花教授鑒定；純化水(屈臣氏集團(tuán)有限公司)，質(zhì)譜乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)，甲酸(Sigma-Aldrich公司)。

1.3 儀器 質(zhì)譜儀MASS(TripleTOF5600+，AB SCIEXTM)；臺式高速冷凍離心機(jī)(Mikro 220R，Hettich)；羅氏全自動生化分析儀(cobas c 311)；移液器(Eppendorf N13462C，德國Eppendorf公司)；粉碎研磨儀(TL-48R，上海萬柏生物科技有限公司)；漩渦振蕩器(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；色譜UHPLC(Nexera UHPLC LC-30A，島津SHIMADZU)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及取材 取雄性大鼠16只，按體重隨機(jī)分為正常組、給藥組訶子1.2857 g/kg(臨床等效量)、每組8只。從實(shí)驗(yàn)第1 d開始，給藥組灌胃相應(yīng)的藥物溶液，每日1次，連續(xù)21d給藥，正常組灌胃等量生理鹽水。末次給藥后，經(jīng) 2% 戊巴比妥鈉(50 mg· kg-1)腹腔注射麻醉，采用腹主動脈取血，在室溫下 靜置半小時后放入3 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，同時采集同一部位肝、腎組織置凍存管，置于-80 ℃ 冰箱中保存待測。

1.4.2 代謝物提取 血清樣本于4℃解凍后，取100 μL加入300 μL甲醇，震蕩提取于12000 rpm，4℃下離心10 min，取上清液進(jìn)樣10 μL，用UPLC-MS檢測。

1.4.3 UPLC-MS檢測 采用Waters BEH HILIC 色譜柱(100×2.1 mm，1.7 μm)。流動相A(0.1%甲酸水，乙酸銨)和B(乙腈)，柱溫35℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。洗脫梯度：95%～50% B，0～16 min；50% B，16～20 min；50%～95% B，20～21 min；95% B，21～22.5 min。

質(zhì)譜參數(shù)條件：采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。ESI源條件如下：離子源 Gas1：50，離子源 Gas2：50，氣簾氣壓力(CUR)：25，界面加熱溫度：500℃(正離子)和450℃(負(fù)離子)，離子噴霧電壓浮動(ISVF)5500 V(正離子)和4400 V(負(fù)離子)，TOF質(zhì)量掃描范圍：100～1200 Da，產(chǎn)物離子掃描范圍：50～1000 Da，TOF MS 掃描累積時間0.2 s，產(chǎn)物離子掃描累積時間0.01 s，二級質(zhì)譜采用information dependent acquisition(IDA)獲得，并采用high sensitivity模式，去簇電壓(DP)：±60 V，碰撞能量：35±15 eV。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、單因素方差分析分別進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

利用Analysis Base File Converter軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ABF格式，再導(dǎo)入MS-DIAL 4.10軟件進(jìn)行預(yù)處理。使用MassBank，Respect，GNPS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。分析各組血清樣本采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析法(OPLS-DA)。篩選VIP≥1及FC>=1.5和P<=0.05作為差異代謝物。再使用MetaboAnalyst 4.0分析代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 PCA分析結(jié)果 PCA通過主要新變量對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，去除重復(fù)性差和異常樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。如圖1、所示，正常組(8)與訶子組(7)的大鼠肝代謝物呈現(xiàn)分離趨勢，說明代謝物具有一定的差異。利用MetaboAnalyst軟件進(jìn)行聚類分析，以熱圖的聚類結(jié)果分析組間差異，顏色深淺表示代謝物水平，紅色為升高、藍(lán)色為降低。如圖2所示，正常組與訶子組的代謝物相對豐度呈有明顯差異。表明，訶子可使大鼠腎代謝物產(chǎn)生一定變化。

圖1 血清代謝物 PCA

圖2 血清代謝物熱圖

2.2 OPLS-DA結(jié)果 OPLS-DA作為一種有監(jiān)督的分析方法，能夠篩選出差異代謝物。如圖3所示，正常組大鼠血清代謝物與訶子組完全分離，說明代謝物譜有顯著差異。通過參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行OPLS-DA 模型驗(yàn)證，具有良好的準(zhǔn)確率和預(yù)測率(參數(shù)R2Y和Q2均大于0.5)。

圖3 血清OPLS-DA的S-plot圖

2.3 差異代謝物的篩選 血清差異代謝物的篩選：為尋找潛在差異代謝物，采用OPLS-DA中VIP≥1和P<0.05，且fold change>1.5(或<0.5)的標(biāo)準(zhǔn)篩選，通過MassBank，Respect，GNPS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析。訶子組血清樣本中篩出2個差異代謝物。與正常組比較，訶子組谷氨酰胺、溶血性磷脂酰膽堿明顯上升，見表1。

表1 血清差異代謝物鑒定

2.4 差異代謝物通路分析 將篩選出的差異代謝物導(dǎo)入MBRole 2.0進(jìn)行通路富集分析。血清差異代謝物涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘧啶代謝、氨基酸的生物合成、嘌呤代謝等通路，見圖4。

圖4 血清樣品代謝通路氣泡圖

3 討論

從血清OPLS-DA的S-plot圖中能看出，給藥組和正常組數(shù)據(jù)點(diǎn)能分開，不重疊，通過血清差異代謝物的篩選發(fā)現(xiàn)供能物質(zhì)谷氨酰胺、溶血磷脂酰膽堿含量明顯增高。

谷氨酰胺主要在大腦組織中生成，骨骼肌，心肌等。是體內(nèi)解除氨毒的重要方式，體內(nèi)谷氨酰胺合成給蛋白質(zhì)提供重要原料[3]；體內(nèi)儲存的氨、經(jīng)過血液運(yùn)輸至肝轉(zhuǎn)運(yùn)利用、進(jìn)一步到腎及小腸等組織中代謝。是合成嘌呤、嘧啶等含氮化合物的重要原料，改善心臟功能，緩解急性心肌梗死癥狀[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，訶子可提高機(jī)體解除氨毒功能，并對改善心臟功能及急性心肌梗死等方面也有一定的促進(jìn)作用。

溶血磷脂酰膽堿(LPC18：2)是磷脂的一種，具有多種生理功能，與糖尿病、動脈粥樣硬化、血脂異常等代謝性疾病和心血管疾病密切相關(guān)。LPC18∶2主要在肝臟代謝，在肝臟疾病和藥物引起的肝毒性血清中LPC 16∶0、LPC18∶0、LPC18∶2、LPC 18∶3或LPC18∶1等多種LPCs的濃度均明顯降低[5-9]。大量研究推測，LPC18∶2將能成為肝臟疾病和肝毒性損傷的生物標(biāo)志物，將對肝臟疾病和藥物肝毒性的診斷與治療發(fā)揮重要作用。另外，較高水平的 LPC18∶2反映其機(jī)體血漿脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。LPC18∶2含量下降可抑制外周游離膽固醇的酯化，被載脂蛋白攜帶最終轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟代謝等脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力受限，增加其血漿膽固醇含量，使肝臟功能受損進(jìn)而其脂肪變性[10-13]。本研究結(jié)果顯示，LPC18∶2含量的提高，可防止肝臟脂肪變性、肝硬化、酒精性肝損傷、非酒精性肝損傷等病理變化。同時可推測訶子對多種代謝性疾病和心血管疾病均有一定的保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與訶子在蒙藥藥性理論指導(dǎo)下所產(chǎn)生的廣泛解毒和調(diào)元作用相符合。訶子被譽(yù)為“藥中之王”、“鎮(zhèn)毒之王”美名具有一定的科學(xué)性和合理性。因此，訶子在含有毒蒙藥復(fù)方發(fā)揮其神奇臨床療效中具有重要的不可替代的角色。