氫氧化鈉和堿性雙氧水預處理對水稻秸稈酶解效果的影響

陳思哲，劉國華*，李 波，齊 魯，王洪臣

1. 中國人民大學環境學院低碳水環境技術研究中心，北京 100872

2. 申能環境科技有限公司，江蘇 杭州 311100

隨著我國經濟社會快速發展，以化石燃料為主的能源消費不斷增加，對環境造成了極大的破壞. 近年來，生物質燃料受到學者的廣泛關注. 在生物燃料研究領域中，發展較快且技術較為成熟的是谷物基乙醇的研究，谷物基乙醇的制備原料主要是甘蔗、玉米和大豆等一些傳統農作物，具有一定的市場前景[1]. 然而，玉米、大豆等是我國重要的糧食作物，對維持我國社會的穩定發展尤為重要，大量使用甘蔗、玉米等糧食作物制造生物燃料，會造成我國糧食短缺的風險. 水稻秸稈是我國的主要農業廢棄物，每年種植產生的水稻秸稈約為2×108t[2]，其中僅有少部分得到合理利用，廢棄的水稻秸稈不僅浪費資源，也對環境造成污染[3-4]. 利用水稻秸稈作為原料制備生物燃料，可以實現資源的再生利用，同時降低對化石能源的依賴，減少環境污染問題.

水稻秸稈的主要成分為纖維素(占35%~50%)、半纖維素(占20%~35%)和木質素(占15%~20%)[5]，可以通過酶解處理使水稻秸稈降解產生可發酵性糖，用于制備生物燃料. 雖然水稻秸稈纖維素含量豐富，但是水稻秸稈作為木質纖維素原料，其纖維素成分與木質素、半纖維素成分緊密結合，使得酶分子難以與纖維素分子接觸，阻礙了纖維素的酶解反應. 此外，纖維素本身結構具有許多高度結晶形態，對纖維素酶的催化水解反應速率影響較大，降低了纖維素的利用效率. 因此，為了充分使纖維素原料糖化，需要使用預處理方法破壞木質纖維素原料中木質素與半纖維素的結構，同時將纖維素的結晶形態轉化為無定形態，使得其更容易被酶或微生物降解[6]. 目前常用的預處理方法有超聲波與微波處理[7-8]、酸處理[9-11]、堿處理[12-13]、有機溶劑處理[14]、蒸汽爆破處理[15-17]、光催化處理[18]和生物處理[19-20]等，其中堿預處理工藝相對簡單，反應條件較為溫和，可以通過皂化反應破壞木質纖維素原料中纖維素與木質素、半纖維素緊密結合結構，同時使纖維素發生潤脹作用，增加纖維素原料的比表面積，降低纖維素成分結晶度，促進酶解反應. 如Li等[21]研究了微波輔助氫氧化鈉預處理水稻秸稈的特性，發現氫氧化鈉能夠顯著降解水稻秸稈中的木質素成分，在微波功率為800 W下，用1%的氫氧化鈉預處理1 h后，水稻秸稈糖化率達到86%；Tri等[22]研究了氫氧化鈉預處理對利用竹葉生產生物乙醇的促進作用，結果表明，使用7%的氫氧化鈉預處理竹葉樣品后，竹葉的糖化率從41.0%提至89.5%，且1.0%氫氧化鈉預處理的竹葉樣品乙醇生產效率最高，轉化率為38.1%；Correia等[23]在研究腰果渣用于生物乙醇生產的過程中發現，氫氧化鈉和雙氧水搭配使用，可以利用氫氧化鈉活化雙氧水的特性，提高雙氧水氧化纖維素原料中的半纖維素與木質素效果，且在35 ℃的條件下，使用4.3%的過氧化氫預處理6 h后糖化效果最好，總糖回收率約為89%；Alvarez-Vasco等[24]以軟木為原料，研究了堿性雙氧水預處理的機理，發現堿性雙氧水預處理能夠去除軟木原料中的大量木質素和葡甘露聚糖，同時幾乎沒有降解原料中的纖維素成分.

該研究對水稻秸稈分別進行氫氧化鈉預處理與堿性雙氧水預處理，以預處理后的水稻秸稈酶解上清液中還原糖含量作為評價指標，對氫氧化鈉預處理工藝與堿性雙氧水預處理工藝進行優化，通過掃描電鏡、傅里葉紅外光譜和X射線衍射分析方法，解析水稻秸稈預處理后的結構變化對酶解糖化效率的影響，旨在初步揭示氫氧化鈉和堿性雙氧水對水稻秸稈的預處理機制，為水稻秸稈的資源化利用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗原料

該試驗所用原料為水稻秸稈，將原料置于70 ℃烘箱中烘干24 h后粉碎，過40目(0.425 mm)篩，干燥貯存備用. 使用的纖維素酶采購自和氏璧生物科技有限公司，最佳使用溫度為50 ℃，pH為4.8，酶活力為104U/g.

1.2 試驗方法

堿性雙氧水預處理. 稱取5 g水稻秸稈，添加到裝有100 mL濃度分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%和1.75%氫氧化鈉和濃度為1%雙氧水的三角瓶中，在40 ℃的條件下，水浴處理5 h，處理后使用蒸餾水清洗水稻秸稈粉末至中性，烘干后取1 g烘干物進行酶解，酶解體系為100 mL，使用濃度為5 mol/L的檸檬酸緩沖液調節溶液pH為4.8，每g秸稈粉末中加入酶0.2 g，于50 ℃的氣浴振蕩箱(120 r/min)中酶解72 h后，測定上清液中的還原糖含量，采用One-way ANOVA分析(顯著水平為0.05)，確定最佳氫氧化鈉濃度. 在最佳氫氧化鈉濃度下，配置溶液中雙氧水濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%，在40 ℃的條件下，水浴處理5 h，在相同條件下對處理后的水稻秸稈進行酶解，測定上清液中的還原糖含量，確定最佳雙氧水濃度. 在最佳氫氧化鈉和雙氧水濃度下，處理溫度不變，分別以1、3、5、7、9、11 h處理水稻秸稈，在相同條件下對處理后的水稻秸稈進行酶解，測定上清液鐘的還原糖含量，確定最佳處理時間. 氫氧化鈉和雙氧水濃度不變，在最佳處理時間下，分別在20、30、40、50、60和70 ℃的條件下處理水稻秸稈，在相同條件下對處理后的水稻秸稈進行酶解，測定上清液中的還原糖含量，確定最佳處理溫度，以上每個處理重復3次.

1.3 測定方法

該試驗使用二硝基水楊酸法測定還原糖含量[25].首先進行葡萄糖標準曲線的繪制，使用紫外分光光度計測定標準葡萄糖溶液在波長為540 nm下的吸光度.以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(ABS)為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=0.293 2x+0.039 8(R2=0.990 9)，將紫外分光光度計測得的吸光度代入葡萄糖標準曲線，得到還原糖含量.

1.4 掃描電鏡分析

取未預處理的水稻秸稈與分別經過氫氧化鈉處理和堿性雙氧水處理后的水稻秸稈樣品分別烘干粉碎后，使用日立SU8020掃描電子顯微鏡(日本)進行掃描拍照，觀察分析水稻秸稈在預處理前后的微觀結構形態變化.

1.5 紅外光譜分析

取未預處理的水稻秸稈與分別經過氫氧化鈉處理和堿性雙氧水處理后的水稻秸稈樣品烘干粉碎，與KBr混合研磨壓片后，采用美國尼高力公司iS10 FTIR spectrometer傅里葉紅外光譜儀對水稻秸稈樣品進行掃描分析，掃描波數范圍為400~4 000 cm?1，繪制紅外譜圖.

1.6 X射線衍射光譜分析

取未預處理的水稻秸稈與分別經過氫氧化鈉處理和堿性雙氧水處理后的水稻秸稈樣品分別烘干粉碎，采用德國布魯克公司D8 ADVANCE X射線衍射儀對樣品進行分析，Cu靶，工作電壓為40 kV，工作電流為40 mA，掃描角度范圍為5°~60°，掃描速率為4 °/min. 根據衍射圖譜強度，采用Segal法計算相對結晶度，其計算公式為

式中，CrI為相對結晶度，I002為晶格衍射角的極大強度，Iam為2θ=18°時非結晶背景衍射的散射強度.

2 結果與討論

2.1 氫氧化鈉預處理對水稻秸稈酶解效果的影響

2.1.1 氫氧化鈉濃度的影響

CEFTIN片用于治療由化膿性鏈球菌敏感菌株引起的成人和兒童（13歲及以上）患者的輕‐中度咽炎或扁桃體炎。

如圖1所示，氫氧化鈉濃度在一定范圍(0.5%~1.25%)內與水稻秸稈酶解效率成正比，氫氧化鈉溶液中的OH?同半纖維素與木質素之間的酯鍵發生皂化反應，溶解水稻秸稈中的木質素，提高酶水解效果，酶解上清液中的還原糖含量由132.70 mg/g增至431.70 mg/g. 氫氧化鈉濃度增至1.25%后，繼續增加氫氧化鈉濃度，水稻秸稈酶解效率顯著下降(P<0.05)，濃度較高的氫氧化鈉溶液會與水稻秸稈原料反應產生糠醛和酮類物質等副產物[26]，對水稻秸稈的酶解過程起抑制作用，使得預處理后的水稻秸稈酶解后還原糖含量降低. 綜上，濃度為1.25%的氫氧化鈉處理水稻秸稈最適宜.

圖1 不同氫氧化鈉濃度下氫氧化鈉預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.1 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by different concentrations of sodium hydroxide

2.1.2 氫氧化鈉預處理時間的影響

如圖2所示，在最佳氫氧化鈉濃度下，隨預處理時間從1 h延至3 h，處理后的水稻秸稈酶解產生的還原糖含量從380.08 mg/g提至431.47 mg/g，酶解效率得到顯著提升(P<0.05). 預處理時間達到3 h后，繼續增加預處理時間，對水稻秸稈酶解效率的影響差異不顯著(P>0.05)，在濃度和溫度固定的條件下，預處理時間的增加并不能顯著提高木質素和半纖維素的降解率[27]，考慮能耗與處理效果，選擇3 h為氫氧化鈉預處理水稻秸稈的最佳預處理時間.

圖2 不同處理時間下氫氧化鈉預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.2 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by sodium hydroxide under different reaction time condition

2.1.3 氫氧化鈉預處理溫度的影響

選用濃度為1.25%的氫氧化鈉溶液，預處理3 h，考察預處理溫度對水稻秸稈酶解糖化的影響. 如圖3所示，在40~80 ℃的溫度范圍內，隨著預處理溫度的升高，水稻秸稈酶解效率有了顯著的提高(P<0.05)，在80 ℃時，預處理水稻秸稈酶解后得到還原糖含量達到480.81 mg/g，酶解產糖率較未預處理水稻秸稈(132.70 mg/g)提高了262.3%. 當預處理溫度超過80 ℃時，氫氧化鈉會繼續降解纖維素與半纖維素為非糖物質，影響了水稻秸稈中纖維素的利用率，預處理溫度為80～90 ℃，對水稻秸稈酶解糖化效果影響不顯著.因此，選擇80 ℃為最佳預處理溫度.

圖3 不同處理溫度下氫氧化鈉預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.3 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by sodium hydroxide under different reaction temperature condition

2.2 堿性雙氧水預處理對水稻秸稈酶解效率的影響

2.2.1 堿性雙氧水中氫氧化鈉濃度的優化

如圖4所示，堿性雙氧水預處理后，水稻秸稈酶解還原糖含量顯著提升，隨著氫氧化鈉濃度的增加，水稻秸稈外側的木質素和半纖維素會被進一步降解，處于內側的纖維素大部分被保留并潤脹，有利于進行酶解過程[28]. 堿性雙氧水中氫氧化鈉濃度為0.5%時，在40 ℃下，水浴處理5 h后，水稻秸稈酶解糖化產生的還原糖含量從未預處理的132.70 mg/g提高至464.89 mg/g，是未預處理水稻秸稈直接酶解產生還原糖含量的3.5倍. 當氫氧化鈉濃度增至1.5%，水稻秸稈酶解還原糖含量達到最大值，為553.12 mg/g，繼續增加堿性雙氧水中氫氧化鈉的濃度，水稻秸稈酶解率呈下降趨勢，過高的氫氧化鈉濃度會破壞內側纖維素結構，導致有效成分流失過多. 因此，應使用濃度為1.5%的氫氧化鈉制備堿性雙氧水預處理水稻秸稈效果最佳.

圖4 不同氫氧化鈉濃度下堿性雙氧水預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.4 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide with different concentrations of sodium hydroxide

2.2.2 堿性雙氧水中雙氧水濃度的優化

由圖5可知，在濃度為1.5%的氫氧化鈉和一定范圍的雙氧水濃度(0.5%~2%)下，固定預處理溫度40 ℃和預處理時間5 h不變，水稻秸稈酶解糖化產生的還原糖含量與雙氧水濃度呈正相關，水稻秸稈酶解糖化效率得到顯著提升(P<0.05)，雙氧水濃度為2%時，水稻秸稈酶解糖化產生的還原糖含量達到最大，為568.58 mg/g. 雙氧水可利用過氧根離子氧化作用降解木質素，同時雙氧水濃度的增加能夠提高氫氧化鈉對水稻秸稈的潤脹作用，增加水稻秸稈的比表面積，增強纖維素酶對水稻秸稈的酶解效果[29]. 當雙氧水濃度超過2%時，水稻秸稈酶解糖化效率降低，過量的雙氧水會造成水稻秸稈中半纖維素成分的減少，同時產生抑制酶解反應進行的副產物. 因此，2%的雙氧水濃度是影響水稻秸稈酶解效率的臨界點，使用濃度為2%的雙氧水制備堿性雙氧水預處理水稻秸稈效果最佳.

圖5 不同雙氧水濃度下堿性雙氧水預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.5 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide with different concentrations of hydrogen peroxide

2.2.3 堿性雙氧水預處理時間的影響

在1.5%氫氧化鈉和2%雙氧水的溶液中，40 ℃的條件下水浴處理水稻秸稈，考察預處理時間對水稻秸稈酶解糖化效果的影響. 由圖6可知，預處理時間由1 h增至5 h，水稻秸稈酶解后還原糖含量顯著增加，由509.91 mg/g增至568.58 mg/g. 繼續延長預處理時間，水稻秸稈酶解后還原糖含量差異不顯著(P>0.05)，試驗過程中發現，堿性雙氧水與水稻秸稈反應初期，有大量泡沫產生，在3 h左右泡沫逐漸消失，由此可見，雙氧水在預處理初期已充分反應，預處理時間延長對水稻秸稈酶解效率促進效果不明顯，堿性雙氧水預處理時間選用5 h較為適宜.

圖6 不同預處理時間下堿性雙氧水預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.6 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide under different time condition

2.2.4 堿性雙氧水預處理溫度的影響

由圖7可知，在1.5%氫氧化鈉和2%雙氧水的溶液中，水浴處理水稻秸稈5 h，水稻秸稈酶解后還原糖含量隨著一定范圍溫度(20~50 ℃)的增加，得到顯著提高(P<0.05)，還原糖含量由458.53 mg/g逐步提至575.85 mg/g，酶解產糖率較未預處理水稻秸稈(132.70 mg/g)提高了336.2%. 但是，當預處理溫度超過50 ℃，酶解得到還原糖含量出現下降，雙氧水穩定性較差，溫度升高使得雙氧水分解速率提高，堿性雙氧水中有效成分降低，導致木質素脫除效果下降[30].所以，在溫度為50 ℃條件下進行堿性雙氧水預處理最為適宜.

圖7 不同預處理溫度下堿性雙氧水預處理水稻秸稈酶解后還原糖含量的變化Fig.7 Changes of the reducing sugar content from rice straw pretreated by alkaline hydrogen peroxide under different temperature condition

2.3 掃描電鏡分析

分別對未預處理、1.25%的氫氧化鈉80 ℃處理3 h、堿性雙氧水(1.5%的氫氧化鈉+2%的雙氧水) 50 ℃處理5 h的水稻秸稈進行電鏡掃描分析，結果如圖8所示. 在預處理前后水稻秸稈的表面形態結構發生了明顯的變化，未預處理的水稻秸稈結構完整緊密，具有連續緊湊的纖維束，部分斷裂是由于粉碎時的物理作用力導致. 比較氫氧化鈉預處理水稻秸稈前后的電鏡掃描圖片后發現，氫氧化鈉溶液會與水稻秸稈發生潤脹作用，在氫氧化鈉處理后水稻秸稈表面出現了較為明顯的糊化現象，處理后的水稻秸稈變成許多碎裂的小塊，水稻秸稈中木質素成分被溶出導致緊密的纖維束被破壞，氫氧化鈉對水稻秸稈的潤脹作用增加了纖維素的比表面積，提高了酶解糖化效率[31]. 比較堿性雙氧水預處理水稻秸稈前后的電鏡掃描圖片后發現，在堿性雙氧水處理后水稻秸稈表面出現了許多孔洞，且表面呈現更為明顯的糊化現象，由此可見，雙氧水促進了氫氧化鈉對水稻秸稈的潤脹作用，使得水稻秸稈變得更加松散，增大了水稻秸稈的比表面積，水稻秸稈表面出現的孔洞是由于雙氧水對水稻秸稈中木質素與半纖維素的分解作用，使得水稻秸稈中的纖維素與木質素、半纖維素的鏈接被破壞，提高了纖維素酶對水稻秸稈的水解效率.

圖8 預處理前后水稻秸稈的掃描電鏡圖片Fig.8 SEM images of rice straw before and after pretreatment

2.4 紅外光譜分析

分別對未預處理、1.25%氫氧化鈉80 ℃處理3 h、堿性雙氧水(1.5%的氫氧化鈉+2%的雙氧水) 50 ℃處理5 h的水稻秸稈進行紅外光譜分析，所得到的紅外光譜如圖9所示. 在紅外光譜圖中，898 cm?1處為纖維素β-糖苷鍵的特征峰[32]，經過氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理后的水稻秸稈，在該特征峰處強度增加，這是由于氫氧化鈉和雙氧水溶解了部分半纖維素與木質素，使得處理后的水稻秸稈纖維素含量增加. 1 515 cm?1處為木質素芳香族苯環骨架振動的特征峰，1 720 cm?1處的特征峰對應木質素中非共軛羰基的伸縮振動峰[33]，與未預處理水稻秸稈相比，這兩個特征峰在經過氫氧化鈉預處理或堿性雙氧水預處理后強度明顯減弱，可見氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理能夠很好地消解水稻秸稈中的木質素成分.1 062、1 159、1 420與1 639 cm?1處均為纖維素的特征吸收峰，2 910和3 410 cm?1附近的吸收峰分別對應碳水化合物?OH和C?H的伸縮振動峰[34]，經過預處理后的水稻秸稈樣品與未預處理的水稻秸稈樣品相比，這幾個特征峰的強度均有明顯的增加，表明氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理均能在破壞纖維素結構的同時，能夠較好保留纖維素和半纖維素等碳水化合物，提高酶解糖化效果.

圖9 水稻秸稈預處理前后紅外光譜圖Fig.9 FTIR images of rice straw before and after pretreatment

2.5 X射線衍射光譜分析

分別對未預處理、1.25%氫氧化鈉80 ℃處理3 h、堿性雙氧水(1.5%的氫氧化鈉+2%的雙氧水)50 ℃處理5 h的水稻秸稈進行X射線衍射分析，所得到的X射線衍射圖譜如圖10所示. 纖維素是水稻秸稈最主要的部分，是以β-1,4糖苷鍵鏈接D-葡萄糖組成的天然鏈狀高分子化合物，纖維素的結構有結晶結構和無定形結構，纖維素的結晶度表示纖維素結晶部分占纖維素整體的比例，反映了纖維素的結晶程度. 預處理前后的水稻秸稈在2θ=22°處有明顯的衍射單峰，對應纖維素Ⅰ的(002)晶面，預處理后該衍射峰強度顯著增強. 由表1可知，與未預處理的水稻秸稈相比，經過氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理的水稻秸稈結晶度有所升高，從21.54%分別升至28.95%和32.33%，這是由于氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理去除了水稻秸稈中的木質素和半纖維素成分，氫氧化鈉的潤脹作用會破壞纖維素的無定形結構，使得水稻秸稈的結晶度增加[35]. 相比氫氧化鈉預處理，堿性雙氧水預處理后的水稻秸稈結晶度變化更大，可見在堿性雙氧水預處理中，雙氧水能強化氫氧化鈉的潤脹效果，加強對水稻秸稈中木質素和半纖維素成分的分解能力[36]. 在26°處出現的尖銳衍射峰為半纖維素的衍射峰，水稻秸稈經氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理后，該衍射峰強度降低，說明氫氧化鈉和堿性雙氧水能夠有效降解半纖維素，提高酶解糖化效率[37].

圖10 水稻秸稈預處理前后XRD圖譜Fig.10 XRD images of rice straw before and after pretreatment

表1 預處理前后水稻秸稈X射線衍射圖譜分析Table 1 XRD analysis of rice straw before and after pretreatment

3 結論

a) 分別對氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理的條件進行優化，氫氧化鈉預處理和堿性雙氧水預處理都能較好地促進水稻秸稈的酶解糖化過程，得到較高的還原糖含量. 氫氧化鈉預處理在使用濃度1.25%、時間3 h、溫度80 ℃的條件下對水稻秸稈進行處理最優，酶解溶液中還原糖含量為480.81 mg/g，比未預處理水稻秸稈酶解液中還原糖含量(132.70 mg/g)提高了262.3%. 堿性雙氧水預處理在使用氫氧化鈉濃度為1.5%與雙氧水濃度為2%的堿性雙氧水、時間5 h、溫度50 ℃的條件下對水稻秸稈進行處理最優，酶解溶液中還原糖含量為575.85 mg/g，比未預處理水稻秸稈酶解液中還原糖含量(132.70 mg/g)提高了336.2%.

b) 電鏡掃描分析表明，氫氧化鈉預處理與堿性雙氧水預處理均能破壞水稻秸稈纖維之間的緊密結構，使水稻秸稈發生斷裂，產生大量孔洞，同時表面出現了明顯的糊化現象，增加了水稻秸稈的表面積，提高了纖維素酶的酶解產糖效率.

c) 紅外光譜與X射線衍射分析表明，氫氧化鈉和堿性雙氧水均能較好地消解水稻秸稈中的木質素，并保留大量纖維素與半纖維素. 雙氧水能夠強化氫氧化鈉對木質素的分解能力，相比氫氧化鈉，堿性雙氧水對水稻秸稈木質素成分的消解效果更好.