KOH和NH3·H2O聯合固態預處理對青稞秸稈厭氧發酵特性的影響

柳 麗，李 潔，白羿雄，杜中平，李 屹，陳來生，韓 睿*

1. 青海大學農林科學院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016

2. 青海省農林科學院，青海 西寧 810016

青稞(Hordeum vulgareL. var.nudumHook. f.)是我國青藏地區種植面積最廣的糧食作物之一，占該地區總糧食作物種植面積的43%[1]. 青稞秸稈作為青稞收獲后的副產品，在青海省年產量已達30×104t，資源量十分豐富，但大部分青稞秸稈卻未能得到有效利用，就地填埋和焚燒的現象仍普遍存在，造成極大的資源浪費和環境污染. 厭氧發酵是一種有效的有機固廢處理技術，不僅可以實現秸稈等農業廢棄物減量化，還能生產出清潔能源[2-3]. 然而，直接利用青稞秸稈進行厭氧發酵卻存在兩個缺點：一是秸稈中緊密的木質纖維素結構嚴重阻礙了底物的水解速度和發酵效率，二是秸稈過高的碳氮比也會抑制甲烷生成[4-5]. 因此，降低秸稈中木質纖維素之間的聚合度、優化發酵系統的碳氮比對于提高青稞秸稈厭氧發酵性能至關重要.

預處理技術是提高秸稈等農業廢棄物厭氧發酵效率的有效手段，其中堿法處理是最為高效的預處理方法之一[6-7]. 相對于其他堿處理試劑，KOH更能夠被回收利用. 例如：Liu等[8]研究發現，KOH預處理可以顯著提高玉米秸稈的甲烷產率，并且預處理過程中添加的大部分K+也能在發酵液中得到保存；Moset等[9]研究發現，KOH不僅可以提高麥草的生物降解性，還能提高發酵液肥料價值. 雖然上述單一KOH預處理可以提高秸稈的厭氧發酵性能，但卻無法調節系統中的碳氮比，因此需要補充額外的氮. Wang等[10]指出，在奶牛墊草熱預處理過程中添加NH3·H2O可以為體系增加氮源，提高甲烷產量；Yuan等[11]發現，NH3·H2O預處理具有增加氮含量和調節碳氮比等優點，有助于提高玉米秸稈厭氧發酵產甲烷能力. 然而，

利用KOH和NH3·H2O聯合預處理秸稈類廢棄物的研究鮮有報道. 與單一的堿處理相比，KOH和NH3·H2O聯合預處理不僅能夠有效降解秸稈中結構緊密的木質纖維素，還能為發酵系統補充氮源，改善發酵環境[10-13]. 此外，預處理期間添加的K元素和N元素也能夠保留在發酵后的沼渣沼液中，并可作為鉀肥和氮肥使用，增加土壤肥力，從而減少回收預處理劑的成本，降低對環境的污染[14-16].

現階段，秸稈厭氧發酵的化學預處理技術大多都伴隨著固液分離和廢液排出所帶來的額外成本和環境污染等問題，極大地限制了秸稈厭氧發酵的工程化應用. 為了在更有效提高青稞秸稈厭氧發酵性能的同時，能夠進一步降低其對環境的污染，該研究選用KOH和NH3·H2O對青稞秸稈進行聯合固態預處理，探討不同含量的KOH和NH3·H2O及預處理時間對厭氧發酵累積甲烷產量的影響，并通過建立響應面模型得到各因素之間的交互作用以及青稞秸稈厭氧發酵最優預處理條件，同時對比分析最優預處理條件下厭氧發酵的產甲烷性能和發酵液的營養價值，以期為青稞秸稈的資源化利用提供理論依據和參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青稞秸稈取自青海大學農林科學院實驗地，自然條件下風干后，用粉碎機粉碎至粒徑2 cm左右，于陰涼通風處保存備用. 接種物取自青海知源特色農業有限責任公司以牛糞為原料運行穩定的農用沼氣池. 接種物取回后，(35±0.5)℃下厭氧培養1~2周至不再產氣以減小背景甲烷產量，將其用作試驗接種物. 發酵原料和接種物的特性見表1.

表1 原料與接種物特性Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum

1.2 預處理試驗

前期預試驗研究發現，當預處理時間為24 h時，7% KOH和5% NH3·H2O單一預處理均能對青稞秸稈厭氧發酵性能起到較好的提升作用. 進行聯合預處理時，考慮到試驗的適用性和可行性，在上述單一預處理基礎上，以KOH含量(2%、4%、6%)、NH3·H2O含量(1%、3%、5%)和處理時間(12、24、36 h) 3個因素作為聯合預處理自變量，預處理后青稞秸稈厭氧發酵累積甲烷產量為響應值，采用Box-Behnken法設計三因素三水平的響應面法優化試驗，試驗因素與水平見表2. 同時，將7% KOH和5% NH3·H2O單一處理24 h的青稞秸稈(分別記為Q和S)與優化條件處理后的青稞秸稈(記為QS)進行對比，并采用未經任何處理的青稞秸稈作為對照(記為CK). 上述預處理系統含水率均設定在70%左右，將配制好的混合溶液與青稞秸稈充分攪拌均勻后放置在廣口瓶內，密封并置于室溫下處理.

表2 試驗因素與水平Table 2 Test factors and levels

1.3 厭氧發酵試驗

厭氧發酵試驗采用全自動甲烷潛力測試儀〔MultiTalent 203，碧普華瑞環境技術(北京)有限公司〕.將500 mL標準批式進料反應器置于恒溫〔(35±0.5)℃〕水浴鍋中，設定每隔3 min攪拌一次，每次攪拌時長為0.5 min. 預處理完成后，按照接種物與青稞秸稈的VS接種比為2:1，分別在不同發酵瓶中加入對應含量的青稞秸稈與接種污泥，并設置只添加接種污泥的空白處理. 各處理組物料添加的總質量為400 g，發酵周期為30 d. 每組均設置3個重復.

1.4 測定項目及方法

總固體(TS)和揮發性固體(VS)含量采用烘干法測定，其中，總固體于烘箱105 ℃下烘24 h，揮發性固體于馬弗爐550 ℃下灼燒3 h；木質纖維素含量由纖維測定儀〔F800型，山東海能科學儀器(中國)有限公司〕參照NY/T 1459?2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》、GB/T 20806?2006《飼料中中性洗滌纖維(NDF)的測定》和GB/T 20805?2006《飼料中酸性洗滌木質素(ADL)的測定》測定；全氮含量采用硫酸-催化劑消解法測定[17]；全磷和全鉀含量分別采用NaOH熔融法-鉬銻抗比色和火焰光度法測定[18]；傅里葉紅外光譜(FTIR)采用固體溴化鉀壓片法進行分析[19].

1.5 數據處理方法

采用SPSS Statistics 22軟件分析數據，采用鄧肯多重比較法，當P<0.05時，數據之間具有顯著性差異；利用Design-Expert 12軟件進行數據擬合與分析；使用Origin 2018制圖.

2 結果與討論

2.1 響應面模型及方差分析

Box-Behnken試驗設計及其結果如表3所示. 將青稞秸稈厭氧發酵累積甲烷產量(Y)設定為響應值，用Design-Expert 12軟件對數據進行多元線性回歸擬合，從而得到累積甲烷產量(Y)對KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)、預處理時間(C)的響應面模型：

表3 Box-Behnken試驗設計及對應的試驗結果Table 3 Box-Behnken design and test results

由表4可見，響應面模型顯著(P<0.05)，但失擬項表現不顯著(P>0.05)，R2=0.949 4，F=14.59，表明該模型能夠對青稞秸稈的累積甲烷產量進行分析與預測，且擬合效果較好. 由各因素的P值可知，KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)為顯著影響因素，預處理時間(C)為不顯著影響因素；A、C交互作用顯著，A、B和B、C交互作用不顯著；A2、B2曲面效應顯著，C2曲面效應不顯著. 由模型一次項及F值可知，各因素對累積甲烷產量的整體影響程度表現為NH3·H2O含量>KOH含量>預處理時間.

表4 響應面模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the response surface model

2.2 響應面優化分析

利用Design-Expert 12軟件繪制響應面模型的三維曲面圖，考察不同因素之間的交互作用對累積甲烷產量的影響. 由圖1~3可知，在試驗設定的自變量范圍內，KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)、預處理時間(C)均存在極值點，說明三者范圍設置比較恰當，擬合曲面的最大值是真實存在的.

由KOH含量和預處理時間交互作用對青稞秸稈累積甲烷產量影響的響應曲面圖(見圖1)可知，在NH3·H2O含量為3%條件下，當預處理時間一定時，隨KOH含量的增大，累積甲烷產量呈現先升高后降低的趨勢. 這說明適宜的KOH含量能夠有效提高青稞秸稈厭氧發酵產甲烷能力，含量過低則產甲烷性能提升效果不明顯，含量過高又可能會抑制微生物活性，影響產甲烷效果[20-21]. 同時，適量的K+也可以刺激產甲烷菌的活性，提高甲烷產量[15]. 當KOH含量一定時，累積甲烷產量隨著預處理時間的延長呈現先升高后降低的趨勢. 這說明適宜的預處理時間能夠有效降解秸稈中的木質纖維素，有益于產甲烷菌生存；預處理時間過長則會過度破壞秸稈的有效成分，進而影響纖維素的酶解效率[22]. 從圖1還可以看出，最高累積甲烷產量出現在KOH含量為5%~6%、預處理時間為12~18 h范圍內. KOH含量的變化坡度較預處理時間的變化坡度更陡，曲線越陡說明因素對響應值(Y)的影響越大，可見KOH含量較預處理時間對累積甲烷產量的影響更加顯著.

圖1 KOH含量和預處理時間交互作用的響應面Fig.1 Response surface diagram of interaction between KOH concentration and pretreatment time

由NH3·H2O含量和KOH含量交互作用對青稞秸稈累積甲烷產量影響的響應曲面圖(見圖2)可知，在預處理時間為24 h條件下，當KOH含量一定時，累積甲烷產量隨著NH3·H2O含量的增加呈現先升高后降低的趨勢. 這表明適宜含量的NH3·H2O不僅能夠有效降解秸稈中的木質纖維素，還能夠為發酵系統提供氮源、調節碳氮比，促進體系產甲烷性能. NH3·H2O含量過低時不能對青稞秸稈進行有效降解，含量過高則可能會產生氨抑制，影響產甲烷菌活性和發酵效率[23-24]. 當NH3·H2O濃度一定時，累積甲烷產量隨著KOH含量的升高呈現先升高后降低的趨勢. 從圖2還可以看出，最高累積甲烷產量出現在KOH含量為5%~6%、NH3·H2O含量在3%~4%范圍內；并且當NH3·H2O含量和KOH含量均處于最低水平時，累積甲烷產量亦最低. 同時，NH3·H2O含量的變化坡度較KOH含量的變化坡度更陡，說明NH3·H2O含量對累積甲烷產量的影響更加顯著.

圖2 NH3·H2O含量和KOH含量交互作用的響應面Fig.2 Response surface diagram of interaction between NH3·H2O concentration and KOH concentration

由NH3·H2O含量和預處理時間交互作用對青稞秸稈累積甲烷產量影響的響應曲面圖(見圖3)可知，在KOH含量為4%條件下，當NH3·H2O含量一定時，隨著預處理時間的延長，累積甲烷產量呈現先升高后降低的趨勢；當預處理時間一定時，累積甲烷產量隨著NH3·H2O含量的升高呈先升后降的趨勢. 從圖3還可以看出，最高累積甲烷產量出現在預處理時間和NH3·H2O含量分別為12~18 h和3%~4%的范圍內. NH3·H2O含量的變化坡度比預處理時間的變化坡度更陡，表明NH3·H2O含量對累積甲烷產量的影響更加顯著.

圖3 NH3·H2O含量和預處理時間交互作用的響應面Fig.3 Response surface diagram of interaction between NH3·H2O concentration and pretreatment time

綜上，NH3·H2O含量對青稞秸稈厭氧發酵積累甲烷產量的影響較大，這與表4所示方差分析結果一致. 經Design-Expert 12軟件優化得到青稞秸稈厭氧發酵的最優工藝條件為KOH含量5.13%、NH3·H2O含量3.35%、預處理時間13.87 h，該條件下累積甲烷產量最大預測值為286.4 mL/g.

2.3 響應面驗證試驗

采用最優組合條件(KOH含量為5.13%、NH3·H2O含量為3.35%、預處理時間為13.87 h)進行3次重復厭氧發酵試驗，用以驗證響應面模型的有效性和準確性. 試驗得到的累積甲烷產量平均值為282.34 mL/g，與預測值(286.4 mL/g)非常接近，相對誤差小于5%，說明該驗證模型有效.

2.4 對比試驗

2.4.1 日產甲烷量和累積甲烷產量

由圖4(A)可知，在30 d的厭氧發酵過程中，對照(CK)、單一預處理(Q和S)和優化條件處理(QS)的日產甲烷量均出現1~2個產甲烷高峰，且集中在前10 d，其中QS的日產甲烷量最大，達到154.77 mL，同時能夠快速進入產甲烷階段. 由圖4(B)可知，QS、Q和S處理組累積甲烷產量較CK均顯著增加(P<0.05)，其中QS的累積甲烷產量最高，分別較Q、S和CK提高了7.59%、20.82%和70.78%. 這說明KOH和NH3·H2O聯合預處理平衡了發酵系統的營養成分，更能夠有效提高青稞秸稈厭氧發酵的產甲烷能力，且所需的含量和時間均低于單一預處理，更具實際應用價值.

圖4 日產甲烷量和累積甲烷產量Fig.4 Daily methane production and cumulative methane production

2.4.2 木質纖維組分含量的變化

不同處理組青稞秸稈木質纖維素的變化情況如表5所示. 由表5可見，與CK相比，預處理后青稞秸稈木質素、纖維素和半纖維素含量均顯著下降(P<0.05)，

表5 不同處理組木質纖維素含量和營養元素含量Table 5 The content of lignocellulose and nutrient elements among different treatment groups

三者去除率分別為23.72%~29.21%、7.81%~10.92%和15.34%~21.31%. 相較而言，木質素的去除率最高，這與Liu等[8]的研究結果相符. 其中，QS處理組的木質素去除率分別比Q和S處理組提高了4.25%和8.88%，說明聯合預處理的木質素降解效果優于單一預處理.

2.4.3 傅里葉紅外光譜圖分析

傅里葉紅外光譜圖(FTIR)是一種能夠表征木質纖維素結構中基團和化學鍵的常用技術手段[25]. 從圖5可以看出，預處理前后的紅外光譜圖形狀大致相同，說明預處理后青稞秸稈的官能團及化學鍵種類沒有發生變化，僅木質纖維素結構發生了改變，表現為某些峰的吸收強度不同. 3 475 cm?1附近為羥基(O?H)的伸縮振動峰，代表木質素的吸收強度[26]；相比CK，該吸收峰減弱，說明預處理破壞了木質素內部的基團，導致秸稈基質孔隙度增加. 其中，QS和Q處理組吸收峰減弱明顯，與表5所示木質素含量分析結果一致. 2 913 cm?1附近的吸收峰是由于C?H中甲基和亞甲基對稱及反對稱拉伸振動引起的，代表纖維素的吸收強度[27]；預處理后該吸收峰減弱，說明在預處理作用下纖維素中部分甲基、亞甲基發生斷裂，纖維素降解. 1 724和1 600 cm?1附近分別是羰基鍵和苯環的吸收峰，代表半纖維素和木質素的吸收強度[28-29]；預處理后兩處吸收峰減弱，表明青稞秸稈中半纖維素和木質素得到有效去除. 1 035 cm?1附近的吸收峰是醚鍵的伸縮振動帶，表示半纖維素的吸收強度[28]，此處吸收峰明顯減弱，說明預處理后半纖維素降解.

圖5 不同處理組的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of different treatment groups

2.4.4 發酵液的營養元素含量分析

由表5可知，與未添加鉀的處理組(S和CK)相比，添加鉀的處理組(QS和Q)中全鉀含量顯著增加(P<0.05)，增加了23.73%~59.17%，這說明預處理過程中添加的鉀能夠有效保留在發酵液中，不會隨著厭氧發酵的進行而消耗. 添加氨水的處理組(QS和S)中全氮含量比未添加氨水的處理組(Q和CK)顯著增加(P<0.05)，增加了6.43%~37.45%，說明預處理過程中添加的氮元素也會有效地保留在發酵液中. 同時，各發酵液中的全磷含量(6.68~7.82 g/kg)大部分差異不顯著(P>0.05)，因為每個處理組中并未額外添加磷元素. 鉀和氮是增加土壤肥力和促進植物健康生長必不可少的營養元素，在發酵系統中添加鉀和氮可以有效提高發酵液的營養價值[30]. 相較于單一試劑處理組，QS處理組保留了鉀和氮兩種營養元素，發酵液的營養價值更高，具有一定的肥料應用潛力. 由于鉀能夠被土壤和植物吸收利用，如果考慮將其發酵液與肥料配施土壤，不僅能夠減少回收預處理試劑的成本，還能夠少施化肥，降低成本.

基于此，在僅考慮KOH預處理成本和發酵液營養價值條件下對該試驗最優處理進行了初步的經濟效益分析. 在400 g發酵體系中，QS處理組KOH消耗量約為0.28 g，即生產1 t發酵液將消耗KOH 0.7 kg，按KOH市面價格8 000元/t計算，生產1 t發酵液成本為5.6元. QS處理組發酵液的全鉀含量高出對照組5.05 g/kg，1 t發酵液能得到全鉀5.05 kg. 以市面上常見鉀肥?氯化鉀(鉀含量為52.45%)為例，推算得出生產1 t發酵液相當于能夠得到9.63 kg的氯化鉀. 按氯化鉀市面價格5 200元/t計算，1 t發酵液能夠產生50.08元的收益，減去前期預處理的投入成本，則凈收益為44.48元. 相比其他堿處理試劑(如氫氧化鈉)，盡管成本相對較低(氫氧化鈉市面價格為4 700元/t)，但發酵液中大量存在的鈉離子如果不去除很可能會造成土壤板結和微生物活性降低等多種問題，危害土壤健康[31-32]，但要去除鈉離子則需要增加額外的回收成本. 綜合考慮經濟收益和環境污染等因素，KOH作為預處理試劑是可行的.

3 結論

a) 響應面法中的Box-Behnken試驗可以很好地對青稞秸稈累積甲烷產量進行預測，響應面模型顯著(P<0.05)，擬合度高，具有較高的可信度.

b) 方差分析顯示，KOH含量、NH3·H2O含量和預處理時間三因素對累積甲烷產量的影響程度表現為NH3·H2O含量>KOH含量>預處理時間.

c) 通過響應面模型驗證試驗得到青稞秸稈累積甲烷產量最優預處理條件為KOH含量5.13%、NH3·H2O含量3.35%、預處理時間13.87 h，該條件下累積甲烷產量實測值為282.34 mL/g，與預測值(286.4 mL/g)非常接近，相對誤差小于5%，證明驗證模型有效.

d) 對比試驗結果顯示，KOH和NH3·H2O聯合預處理能夠顯著提高青稞秸稈厭氧發酵的產甲烷能力(P<0.05)，同時能夠有效降解木質素(降解率為29.21%)，提高發酵液營養價值，是高效生產生物甲烷和環境友好的木質纖維素類廢棄物的處理方法.