白藜蘆醇誘導早幼粒白血病HL-60細胞凋亡的磷酸化蛋白質組研究

文東虎

(齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院 黑龍江 齊齊哈爾 161041)

白藜蘆醇(RSV)是多酚類化合物,又稱芪三酚,是腫瘤的化學預防劑，化學名稱是3,4,5-三羥基苯二烯[1]。白藜蘆可不僅可殺菌，還可抗炎、癌等。最近幾年，RSV抗腫瘤作用是研究核心，不同細胞，RSV誘導細胞凋亡機制與之存在很大不同，經研究發現RSV會引起HL-60細胞凋亡，此作用呈時間、劑量是雙依賴性，其原理與活性氧(ROS)有聯系。但ROS的發生與RSV導致HL-60細胞死亡有聯系，本研究經遏制ROS的產生，發現細胞凋亡未得到科學抑制[2]。按此推測，除過ROS將線粒體死亡通路激活外，需與另外路徑相結合加入RSV抗腫瘤效用。因此，本研究需結合蛋白組方式分析RSV處理HL-60細胞所有磷酸化蛋白質干擾，初步掌握RSV誘導入HL- 60細胞凋亡的其他理念。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

材料：人造幼粒白血病細胞HL-60細胞株。

儀器和試劑：雙向電泳裂解液、水化液，樣品混合器、離心機、垂直電泳儀、TPG預制膠條、脫色搖床。

1.2 方法

1.2.1 細胞裂解

備好量皿處在對數生長階段的HL-60細胞，一皿細胞中添加白藜蘆醇，確保期RSV最終濃度100mol/L，另外一名細胞用于參照。經12h的培養對細胞進行收集，取離心管置入細胞懸液，以500g/min速度離心10min后，將上清液去除，后取冷PBS清洗細胞3次，500g/min，離心10min，放棄上清液。取離心管重新離心，500g/min，共2min，離心后充分吸收液體，一同稱取細胞與管，掌握所收到的細胞質量。將收集的細胞置入-80℃冰箱冰凍保存>2h。從冰箱中取出細胞后，等細胞的溫度恢復后細胞重懸用緩沖液完成，約30L/mg，按照細胞質量，找尋緩沖液A體積，等細胞均勻后，上下搖晃懸液20次。在4℃環境下孵育細胞懸液10min，每分鐘顛倒離心管1次，10min后將其1.5mL轉移到至EP管。10000g/min離心20min，確保無溶解溶質的沉淀。

1.2.2 親和層析柱分離富集磷酸化蛋白質

在干凈的管中轉移上清液，此上清液即總蛋白；分出部分蛋白樣品測定蛋白濃度，另一部分用于提取磷酸化蛋白。提前在室溫處置放親和柱。將親和柱上下帽取下，排除儲存液。用蒸餾水清洗柱子，利用緩沖液保持平衡，知道流出液體的PH數值<6.0。叩上底帽。取蛋白樣品上柱，蛋白樣品總量控制在4mg-8mg，每次<5mL。蓋好頂帽，柱子置于4℃搖床上輕度晃動20min。豎直置放5min；輕輕打開親和柱底帽、頂帽。收集后-20℃保存。用緩沖液A對柱子進行清洗，5mL/次，添加1mL緩沖液B對柱子清洗，4℃采集洗脫液，這種洗脫液即是磷酸化蛋白。用緩沖液B抽工夫對柱子進行清洗，收集洗脫液。

1.2.3 蛋白樣品除鹽

因其所采集的磷酸化蛋白通常濃度低下，我們用超濾法將蛋白濃縮，有效提高蛋白濃度、脫鹽作用。部分獲得的磷酸化蛋白在超濾管中田間，按7000g/min，低溫迅速離心40min，完成離心后，添加適當的裂解溶液將蛋白溶解，待蛋白溶液溶解后將其轉到干凈的EP管，取適量樣品BCA對蛋白濃度進行測定。

1.2.4 雙向電泳與質譜測定

水化：室溫溶解一定劑量的水化液后，添加4LDTT，2L，Pharmalyte3-10,混合均勻。預測樣品蛋白濃度后，選50L樣品，用均勻的水化液體補充在125L。結合膠條長度，順水化盤槽線添加樣品。消除預制的IPG膠條保護層，膠面向下放置在水化盤樣品溶液中，預防氣泡的出現，接著覆蓋礦物油3mL。

第一向等電聚焦：膠條水化時間達16h后，轉移至聚焦盤，聚焦盤正極正對聚焦盤。為保障膠條親密接觸電極，7cm膠條取干凈濾紙為鹽橋在兩極放置，膠條膠面向下搭于鹽橋，蓋上礦物油3mL，與正負極對應，蓋好蓋子。7cm的膠條等電聚焦程序是：100V5min；500V1h：1000V1h；8000V、55000V數小時；2000V24h；設置溫度18-20℃。

第二向SDS-PAGE電泳：膠條被聚集后，合理使用平衡緩沖液平衡。接著取膠條在SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上置放，加入熔點低的瓊脂糖封膠液，待其全部凝固后執行SDS-PAGE電泳。結束電泳后銀染，經掃描分析，分析切2倍以上差異點質譜。

1.3 觀察指標

(1)觀察雙向電泳分離磷酸化蛋白質。(2)觀察鑒定分析差異蛋白點質譜。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 雙向電泳分離磷酸化蛋白質

此實驗用雙向電泳技術，結合蛋白質等電點、相對分子質量不同，對照組HL-60細胞、100mol/LRSV、12h干預的HL-60細胞獲取磷酸化蛋白開展雙向電泳，經一向等電聚焦、二向SDS-PAGE后，分離各蛋白點。銀染凝膠后使用掃描儀進行檢查。用PDQuest雙向電泳軟件分析獲取表達蛋白不同，取得兩組蛋白點數240個、190個，表達差異的蛋白質點數達13個，將其標注出來，選擇部分放大。

2.2 鑒定分析差異蛋白點質譜

從蛋白質水平來看，蛋白質組學可為細胞提供正常、非正常環節細胞于生理上的發展與路徑。經用2-DE與質譜技術在其所檢測的HL-60細胞中磷酸化蛋白，取PDQuest雙向電泳軟件分析表達蛋白的不同。經放大部分差異點，取部分分辨清晰的差異點經酶切，質譜判斷部分蛋白質，通過數據庫對NCBI蛋白質的主要作用進行搜索，見表1。

表1 判斷雙向電泳后質譜測定兩組差異磷酸化蛋白功能與名稱

3 討論

人急性早幼粒白血病細胞HL-60是通過分離患此病的患者外周建立，會自行發生分化，還可用丁酸鹽、視黃酸刺激等實現分化。PMA在受到刺激后會分泌TNF-α[3]。該細胞會對活性造成吞噬，引起趨化反應。癌基因myc呈陽性，所呈現的受體為補體、FcR。 血管平滑肌細胞的再生能力是原發血管病變的重要因素，表達鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應，與血管疾病的進展和穩定有關[4]。其基本特征是：肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin免疫熒光染色。細胞分化前主要表現是生長阻滯，分裂能力降低。所以，分化誘導很多能夠對細胞生長進行抑制[5]。培養細胞復蘇時取出液氮罐凍存管，及時存放在37℃下水浴，不斷搖晃，使其迅速融化。取出溶解好的細胞凍存管，使用酒精消毒后打開，吸收含有細胞的凍存液，添加提前準備的培養液，離心、預熱，吹打均勻，1000rpm 5min，去掉上清，添加適量培育液，吹達為細胞懸液，按1*105/ml密度在25cm2培養瓶實施接種，在37℃、5%co2環境下培養。

蛋白質在人體中可執行各種生命活動，生命活動期間，各類活動變化最終均會出現蛋白質水平改變。蛋白質組學在各技術手段中的開展，主要包含2-DE，是從整體出發對細胞中蛋白質構成部分進行研究，掌握蛋白質之間的聯系，呈現蛋白質之間關系密切，展現蛋白質功能[6]。最近幾年，蛋白質組學技術得到發展迅速，其中具備差異的蛋白質組學為當前這方面研究中可行的路徑，雙向電泳為蛋白質組學的要點，是唯一分離蛋白質是的技術，不僅檢測方法簡單，且快速，具有較高分辨率，重復性好[7]。

本研究中，現用2-DE與對應的PDQuest軟件，對對照組HL-60細胞、100mol/L處理12h后HL-60細胞提取磷酸呼哈蛋白點比較，取得兩組蛋白點數240個、190個，10個差異表達的蛋白質點。選擇分辨清晰的差一點經酶切，對部分蛋白質進行鑒定，通過數據庫搜索NCBI蛋白質的功能[8]。一是核磷蛋白(nuclephosmin)屬于核蛋白，表達甚廣，在胞漿、細胞核間穿梭，生物學功能豐富，操作控制中心體折疊，其功能十分重要。內網中包含ER-60蛋白酶，降解保守蛋白后，會使半胱氨酸蛋白酶有活性；帶負電荷硫脂類可對ER-60蛋白酶造成抑制[9]。ER-60與蛋白質折疊息息相關，CCT2是蛋白中存在TCPl，亞基2，在細胞質中分布，加入蛋白折疊功能，經對蛋白質功能觀察發現二者均和蛋白質的折疊有關系。ER中，伴侶分子輔助的多肽折疊、修飾促使蛋白成熟并發生變化。ER內部環境穩定，科學調節信號，決定著折疊的正確性[10]。產生刺激導致ER折疊削弱蛋白能力時，應激信號會通過ER膜運輸到細胞核，提高靶基因轉錄，蛋白質翻譯水平降低，激活保守度高且未出現折疊蛋白反應的信號傳導通路。UPR經對普通蛋白合成抑制，調高ER殘余的蛋白，對另外通路成分進行調節，保障ER蛋白效率折疊。UPR經對普通蛋白合成的遏制，上調殘存伴侶蛋白，保障ER蛋白充分折疊[11-12]。但若刺激無法減輕，UPR會引起死亡。激活URP信號后會轉化成UPR受體，引起Chop/GADD153活化，若其表達較高時，會影響ER蛋白折疊功能，暫停細胞周期，損傷DNA，最終使細胞凋亡。

綜上所述，內質網蛋白質功能復雜，信號折疊路徑為白藜蘆醇誘導細胞死亡機制鋪設新道路。經雙向電泳會發現差異蛋白，如：抑制素就具有顯著的表達差異，其死亡與誘導有一定關系，這為將來白藜蘆醇誘導腫瘤細胞死亡機制奠定基礎。