新鄉地區支氣管哮喘患兒發病風險與相關核轉錄因子等位基因間相關性探討

郭麗娟

（河南省新鄉市第二人民醫院 兒科，河南 新鄉 457300）

支氣管哮喘是兒科常見慢性呼吸系統疾病之一，有報道顯示14 歲以下人群發病率約為3%～4%；目前該病已成為影響兒童生長發育重要疾病，給家庭及社會和帶來極大負擔［1］。目前有關支氣管哮喘病因及發病機制仍存在爭議，大部分學者認為支氣管哮喘發生受多種因素綜合影響，除環境因素外遺傳因素亦在其中發揮著關鍵作用［2］。核轉錄因子STAT3 已被證實可參與到人體正常生理、感染及腫瘤病理生理改變；有報道證實不同免疫系統疾病發生可由相同基因多態性介導并能夠相互影響疾病通路調節［3］；而STAT3 基因多態性與系統性紅斑狼瘡和潰瘍性結腸炎易感性有關［4］。基于以上證據，本次研究納入河南省新鄉市第二人民醫院2018 年1 月至2020 年1 月收治的小兒支氣管哮喘患兒260 例和體檢健康兒童290例，采用SSP-PCR 法檢測核轉錄因子STAT3 基因單核苷酸多態性（SNP），探討本地區小兒支氣管哮喘發病與相關核轉錄因子等位基因間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究納入河南省新鄉市第二人民醫院2018 年1 月至2020 年1 月收治的小兒支氣管哮喘患兒260 例和體檢健康兒童290 例；支氣管哮喘患兒中男148 例，女112 例，年齡4～9 歲，平均（6.27±2.40）歲；體檢健康兒童中男158 例，女132 例，年齡4～8 歲，平均（6.09±2.27）歲。兩組性別和年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標準

支氣管哮喘組：均符合兒童變應性哮喘診斷及分度標準［5］，年齡≤14 歲，同時排除川崎病、炎癥性腸病及其他免疫系統疾病；體檢健康組：年齡≤14 歲，近4 周無感染或發熱，排除近4 周使用激素或免疫抑制劑，既往過敏或其他免疫系統疾病史。研究方案經河南省新鄉市第二人民醫院倫理委員會批準，且患兒家長知情同意。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取和引物設計 抽取外周靜脈血2 mL 加入EDTA 抗凝管，取200 μL 采用DNA 提取試劑盒（Qiagen）完成目標DNA 提取，置入-80℃冰箱待檢。引物設計合成由英濰捷基公司完成，根據已知STAT3 基因組序列設計SNP 位點正向引物，包含SNP 位點質控正向引物和通用反向引物。具體引物情況：rs2293152 特異正向引物為AACGCGCCTACTTCTTTCCTGCCC，特異反向引物為TAAGTTCCTCTCCTGGCTGTTCCG；rs957970 特異正向引物為CTTATGACATTCTCCAGGTTCATC；特異反向引物為TCTCGTCACGTTTACAAGTAATGCT。

1.3.2 SSP-PCR 反應和瓊脂糖凝膠電泳 采用25 μL 反應體系，包括特異性引物0.5 μL、質控正向引物0.5 μL、通用反向引物1 μL、2×PowerTaq Master Mix 12.5μL、DNA 模板2μL，最后加入ddH2O 補足25 μL。rs2293152 反應條件設置：95℃預變性5 min，95℃變性30 s 共8 個循環，60℃退火45 s，72℃延伸45 s；95℃變性30 s 共25 個循環，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。rs957970 反應條件設置：95℃預變性5 min，95℃變性30 s 共35 個循環，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR 產物加入瓊脂糖凝膠（15 g/L），電泳儀電壓設定110 V，電泳35 min，采用耶拿UVP Gelstudio touch 凝膠成像儀顯像。

1.3.4 質控PCR 產物測序及驗證 每個位點隨機抽樣選取3 分樣本采用質控正向引物和通用反向引物擴增，擴增產物包含SNP 位點，產物送至英濰捷基完成直接測序，將測序SNP 位點基因型結果和SSP-PCR 檢測結果對比驗證。

1.4 統計學方法

選擇SPSS 22.0 軟件處理數據，計數資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相對危險度評估采用優勢比法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H-W 遺傳平衡檢驗分析

H-W 遺傳平衡檢驗分析顯示，對照組STAT3基因兩個SNP 位點基因型分布頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示納入研究對象具有群體代表性。

2.2 PCR 產物測序質控結果分析

隨機抽取樣本采用質控引物擴增后含SNP 位點產物直接測序基因型結果與SSP-PCR 法檢判定基因型相同，證實SSP-PCR 法檢測基因位點準確。

2.3 兩組基因型和等位基因分布差異分析

支氣管哮喘組rs2293152 位點CC 基因型比例高于體檢健康組，差異有統計學意義（P＜0.05）；支氣管哮喘組rs2293152C/G 位點C 等位基因比例高于體檢健康組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C 等位基因兒童發生支氣管哮喘風險為G 等位基因1.57 倍（=1.57，95%CI：1.07～2.33）。兩組rs957970 位點基因型和等位基因比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組基因型和等位基因分布差異分析 ［n(%)］

3 討論

支氣管哮喘目前已成為全球性疾病，在發達國家和發展中國家發病率均較高，同時發病率、致死致殘率和病死率均呈逐年增高趨勢；而小兒支氣管哮喘患兒往往會對生長發育及身心健康產生不利影響［6］。如何進一步探索明確支氣管哮喘病因及發病機制以實現疾病早期預防對于改善兒童生活質量及遠期預后越來越受到醫學界的關注。

喘息是學齡前兒童呼系統常見癥狀之一，根據病情進展情況可分為早期一過性喘息、早期持續性喘息及遲發性喘息或哮喘［7］。一般僅存在特應性因素的遲發性喘息患兒可進展形成支氣管哮喘；對于此類患兒早期診斷早期干預理論上可降低小兒支氣管哮喘發病風險，但目前臨床仍沒有具有較高準確性和特異性預測指標［4］。支氣管哮喘已被證實屬于多基因遺傳性疾病，直系親屬發病比例可達35%～75%［8］。近年來探索支氣管哮喘致病基因等分子遺傳學研究不斷深入，候選基因定位克隆是目前疾病易感基因主要遺傳學分析方法，目前200 個以上支氣管哮喘發病候選基因已被篩選，參與到機體炎性反應、免疫識別及細胞胞內信號轉到等多種生物學活動，如人類白細胞抗原Ⅱ（HLA II）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、Toll樣受體及白細胞介素（IL）等，基因型均與支氣管哮喘有關［9-10］。

核轉錄因子STAT3 可在人體內多種組織及細胞中表達，作為一種DNA 結合蛋白，其在無功能狀態下被胞外信號激活，磷酸化后在細胞核內與特異DNA 片段結合，進而調控相應基因轉錄表達，發揮調解細胞增殖分化、腫瘤發生及感染進展等多方面［11-12］。已有研究［13］顯示，支氣管哮喘模型小鼠呼吸道上皮平滑肌細胞STAT3 基因敲除后，塵螨抗原激發呼吸道反應性顯著下降，推測STAT3 可能參與到支氣管哮喘病情進展過程中。另有報道［14］提示，支氣管哮喘患兒血清STAT3 表達水平可見顯著提高。此外SSP-PCR 法檢測基因多態性位點與直接測序法檢測結果具有較高一致性，檢測快速且價格相對低廉［2］，故本研究采用SSP-PCR 法分析STAT3 基因多態性與小兒支氣管哮喘間關系。

本次研究采用SSP-PCR 法檢測本地區STAT3基因，結果顯示本地區STAT3 基因rs2293152 和rs957970 均存在SNP，其中rs2293152 位點基因型分布頻率與國外報道存在差異［15］，筆者認為這可能與納入人群種族和地區差異有關。同時支氣管哮喘組rs2293152 位點CC 基因型比例高于體檢健康組（P＜0.05）；支氣管哮喘組rs2293152C/G 位點C 等位基因比例高于體檢健康組（P＜0.05）；C 等位基因兒童發生支氣管哮喘風險為G 等位基因1.57 倍（=1.57，95%CI：1.07～2.33），證實表明rs2293152C/G 位點C等位基因可能與小兒支氣管哮喘發生有關，屬于易感基因，故可針對此類人群可能早期干預。但兩組rs957970 位點基因型和等位基因比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05），則說明rs957970 位點SNP 與小兒支氣管哮喘發生無關。以上結果為明確小兒支氣管哮喘致病基因提供更為充足證據。

本次研究亦存在一定不足：①作為小樣本單中心回顧性報道，所得結論無法完全排除混雜因素影響；②因臨床資料不全無法進一步分析rs2293152 位點多態性與小兒支氣管哮喘疾病嚴重程度相關性，而是否可影響STAT3 基因表達及生理功能仍需后續研究確證。

綜上所述，本地區小兒支氣管哮喘發病與STAT3 基因rs2293152C/G 位點有關，其中C 等位基因可能為常見易感基因。