骨髓間充質干細胞來源細胞外基質/膠原蛋白支架促進成纖維細胞運動和遷入*

闞鵬，顧家燁，芮敏，惠宇堅，沈建國

（東南大學附屬江陰醫院 骨科，江蘇 無錫 214400）

創傷、燒傷、癌性潰瘍、糖尿病足等各種原因導致的軟組織缺損創面是一類常見病，容易造成膿毒癥、截肢等嚴重后果，給患者帶來巨大的心理和經濟負擔［1］。皮膚移植是修復此類創面的常用方法，但存在缺少供區、造成新損傷和操作復雜等缺點［2］。近年來，促進軟組織重建的生物材料獲得臨床應用。這些材料通過特定的空間結構、生物信號和生物力學刺激引導組織重建，可避免組織移植或減少自體組織的用量［3］。一些研究顯示，脫細胞基質能顯著促進組織原位重建［4］，但存在制備工藝難以控制、疾病傳播、核酸殘留等缺點。而合成支架材料因原料性質穩定、制備工藝易于控制等優點能有效避免上述不足。臨床現有的合成支架材料如膠原蛋白支架能為修復細胞提供三維生長空間，但由于缺乏對修復細胞的趨化活性以及誘導細胞遷移的功能，合成支架材料促進組織重建的速度緩慢，在嚴重軟組織缺損創面如肌腱外露創面修復中的應用受到限制［5］。臨床聯合應用負壓封閉引流系統和膠原蛋白支架，以促進修復細胞長入支架，從而加速組織新生。因此，具有對修復細胞的趨化活性和誘導細胞遷移的合成支架材料成為國內外研究的熱點。

本研究的目的是構建體外培養骨髓間充質干細胞來源細胞外基質（bone-marrow mesenchymal stem cell-derived ECM,BM-ECM）和Ⅰ型膠原蛋白的復合支架（BM-ECM/膠原蛋白支架），通過引入BM-ECM，賦予膠原蛋白支架對修復細胞的趨化活性，以及促進細胞遷移和長入支架內部的功能。通過掃描電子顯微鏡觀察材料的微觀結構，并測試了材料的傅里葉紅外吸收光譜。在體外實驗中，通過Transwell 遷移實驗檢測在BM-ECM/膠原蛋白支架影響下成纖維細胞的過膜率，并檢測了在BM-ECM/膠原蛋白支架作用下成纖維細胞劃痕傷口愈合率。在體內實驗中，通過小鼠皮下埋植模型，檢測了長入BM-ECM/膠原蛋白支架的細胞密度并觀察了細胞在支架中的分布情況，并通過免疫組織化學觀察了成纖維細胞在支架中的分布。本研究構建了一種對修復細胞具有趨化活性并增強細胞遷移的復合支架，為軟組織缺損修復提供新材料，也為新型軟組織缺損創面修復材料的設計提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原代細胞取自6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，6只，體重（18.2±0.9）g。動物實驗中使用的小鼠為6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，12 只，體重（18.5±1.4）g。所有動物均購自常州卡文斯實驗動物有限公司。原代細胞培養實驗和動物實驗均遵循東南大學附屬江陰醫院和國家有關實驗動物管理和使用的規定。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物）；鼠尾Ⅰ型膠原蛋白、2 500 u/mg 胃蛋白酶（上海Sigma-Aldrich 公司）；蘇木精-伊紅染色試劑盒、抗ER-TR7 抗體［艾博抗（上海）貿易有限公司］；其他試劑均由國藥集團和賽默飛中國有限公司提供。

1.2 儀器與設備

SU-1510 型掃描電子顯微鏡（日本株式會社日立高新技術那珂事業所）；CX23 生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Ti2 激光共聚焦顯微鏡［尼康儀器（上海）有限公司］。

1.3 試驗方法

1.3.1 支架的制備 按文獻［6］所述方法分離和培養6 周齡C57BL/6J 小鼠骨髓間充質干細胞，待傳至第4 代時，將生長至100% 融合的細胞在含有50 mmol/L 抗壞血酸的DMEM 培養基中繼續培養2 周，PBS 潤洗，加入含20 mmol/L 氫氧化銨的1% 曲拉通PBS 溶液，常溫孵育5 min 將細胞裂解；用細胞鏟刮離培養物，然后用100 IU/mL 的DNase Ⅰ常溫處理1 h，以除去培養物中的DNA；30 000 g 離心20 min，獲得BM-ECM，并用生理鹽水潤洗和離心，重復3 次；用含0.1%胃蛋白酶的0.01 mol/L 鹽酸溶液（3 mL/75 cm2培養瓶）常溫下消化BM-ECM，過夜；加入333 μL 的10×PBS 溶液中和消化液，并用PBS 進行透析（截留分子量15 kD），獲得BM-ECM 溶液，采用Pierce BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定終溶液的蛋白水平為（0.29±0.04）mg/mL。BM-ECM/膠原蛋白支架的制備：取含0.5%I 型膠原蛋的乙酸溶液8 mL，加入2 mL 上述BM-ECM 溶液，用勻漿機在冰浴條件下混勻，離心除去氣泡；將所得溶液按500 μL/孔加入24 孔細胞培養板中，放置在-80℃冰箱冷凍凝固；冷凍干燥后，在飽和戊二醛蒸汽環境中放置15 min 后取出，放于常溫真空干燥箱中1 h，除去多余的戊二醛分子，得到交聯的BM-ECM/膠原蛋白支架；用生理鹽水代替BM-ECM 溶液且不改變其他支架制備過程和條件，獲得膠原蛋白支架。

1.3.2 FT-IR 和SEM 采用NicoletiS10 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀測試BM-ECM/膠原蛋白支架和單純膠原蛋白支架的紅外吸收光譜，檢測范圍4 000～500 cm-1，溫度為室溫，分辨率為4 cm-1。將支架裁成5 mm×5 mm×2 mm 的正方體，用導電膠粘貼在掃描電子顯微鏡臺上，支架內部切片朝上，經干燥和噴金處理后，觀察支架內部微觀形貌。

1.3.3 支架皮下埋植動物實驗 將12 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠適應性飼養1 周，行異氟烷吸入性麻醉，用脫毛膏脫除小鼠背部毛發，用乙醇和碘伏消毒手術區域，在消毒區域中線兩側各制作長度5 mm 的縱向切口，切口距離大于1 cm；用組織剪撐開切口肉膜和筋膜，將直徑為5 mm、厚度為1.5 mm 的BM-ECM/膠原蛋白支架和單純膠原蛋白支架植入肉膜和筋膜之間的口袋，左側植入BM-ECM/膠原蛋白支架，右側植入單純膠原蛋白支架，縫合切口，消毒。術后5 d、10 d，隨機取6 只小鼠，經二氧化碳安樂死后，切取埋植支架及相鄰皮膚組織，用40 g/L 多聚甲醛固定12 h，一半進行冰凍切片，切片厚度5 μm，剩余一半進行脫水、石蠟包埋和切片，切片厚度為4 μm。石蠟切片按生產廠家說明書行蘇木精-伊紅染色；冰凍切片行抗ER-TR7 免疫化學染色，行ER-TR7 抗體（1∶100）和山羊抗兔Alexa Fluor 647 標記二抗（1∶200）孵育，并用DAPI 復染。采用正置顯微鏡觀察蘇木精-伊紅染色切片，激光共聚焦顯微鏡觀察ER-TR7 染色切片。使用Image J 軟件進行圖像處理和細胞計數，選取H&E 圖像中距離支架上緣約0.1 mm、邊長為0.1 mm 的正方形區域，計數細胞數量并計算細胞密度。。

1.3.4 纖維細胞趨化和劃痕愈合體外實驗 將第3 代人真皮成纖維細胞（Sigma-Aldrich，美國）復蘇12 h 后，用含1%牛血清白蛋白的DMEM 培養基饑餓細胞12 h，胰酶消化，用含10%牛血清白蛋白的DMEM 培養基重懸細胞，使細胞濃度達到1×105/mL；在Transwell 上室中加入200 μL 人真皮成纖維細胞懸液，下室分別加入500 μL DMEM基礎培養基（空白）或含BM-ECM/Col 支架或Col支架（約5 mg 干質量）的DMEM 培養基，在37 ℃、體積分數為5% 二氧化碳培養箱中孵育12 h、24 h 后，取上室，用棉簽徹底擦除濾膜上表面細胞，然后用結晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照，并按下列公式計算過膜細胞密度：細胞密度（/mm2）=視野內細胞數量÷視野面積（mm2）。復蘇、消化和重懸細胞同趨化實驗。將重懸的細胞接種于24 孔板，接種密度5.0×104/cm2，細胞貼壁后繼續培養兩三天，細胞長至80% 融合，用200 μL 移液器槍頭在孔中央畫1 條劃痕，吸除培養基，加入1 mL DMEM 基礎培養基（空白）或含BM-ECM/Col 支架或含Col 支架（約5 mg 干質量）的DMEM 培養基，在0 h、24 h、48 h 時，于100 倍鏡下拍照并計算細胞向劃痕中央遷移距離與初始距離的百分比。

1.4 統計學方法

所有數據采用SPSS 11.5 軟件包進行分析。計量資料以均數±標準差（）表示，各組間數據的比較依據資料的性質，采用t檢驗或方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 支架微觀結構

掃描電鏡觀察顯示，BM-ECM/膠原蛋白支架和單純膠原蛋白支架內部均呈相互連通多孔結構，孔徑分布在100 μm 左右，見圖1。兩種支架的多孔結構和孔徑差異無統計學意義（t=0.396,P=0.703）。

圖1 兩種支架內部結構的掃描電鏡圖片

2.2 傅里葉紅外吸收光譜

兩種支架都存在膠原蛋白肽鍵Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ特征吸收峰，分布在1 300～1 700 cm-1區間。相比單純膠原蛋白支架，BM-ECM/膠原蛋白支架在1 235 cm-1出現特征峰，提示磺酸基團（S=O 伸縮震動）的存在；在1 200 cm-1的吸收峰強度增強，提示糖環（異頭C-O-C 伸縮振動）的存在，見圖2。磺酸基團和糖環的特征吸收峰表明BM-ECM/膠原蛋白支架中存在糖胺聚糖、低聚糖等細胞外基質分子。

圖2 兩種支架的傅里葉紅外吸收光譜

2.3 小鼠皮下埋植支架中遷入細胞的密度

蘇木精-伊紅染色顯示，術后5 d 時，細胞出現在兩種支架的淺部區域，并有少量細胞散布于深部區域；術后10 d 時，BM-ECM/膠原蛋白支架深部區域出現大量細胞，單純膠原蛋白支架的深部區域分布的細胞較少，見圖3。定量結果顯示，BM-ECM/膠原蛋白支架內部的代表性區域的細胞密度為（2.86±0.34）×103/mm2，高于單純膠原蛋白支架（1.33±0.21）×103/mm2，差異有統計學意義（t=8.581,P＜0.001）。

圖3 小鼠皮下埋植支架中的細胞遷入和分布情況（蘇木精-伊紅染色）

2.4 成纖維細胞在支架中的分布

通過抗小鼠ER-TR7 免疫染色顯示了成纖維細胞在支架中的分布。術后10 d，BM-ECM/膠原蛋白支架內部的細胞大部分為ER-TR7 陽性，這些細胞在支架內部均勻分布。而單純膠原蛋白支架中，ER-TR 陽性細胞集中分布于淺部區域，見圖4。上述結果表明，成纖維細胞遷入BM-ECM/膠原蛋白支架的能力顯著高于單純膠原蛋白支架。

圖4 小鼠皮下埋植支架中的成纖維細胞分布情況（抗ER-TR7 免疫染色和DAPI 細胞核染色）

2.5 支架對成纖維細胞趨化作用

孵育12 h 后，與單純膠原蛋白支架和無支架相比，下室放置BM-ECM/膠原蛋白支架條件下，穿過Transwell 膜的人真皮成纖維細胞明顯較多，見圖5A；孵育24 h 后，BM-ECM/膠原蛋白支架、單純膠原蛋白支架、無支架3 種條件下，相比12 h 時，過膜細胞均有所增多。定量分析結果顯示，孵育12 h、24 h 后，相比單純膠原蛋白支架或空白支架，BM-ECM/膠原蛋白支架作用下穿過Transwell 嵌套膜的細胞數均著增多，差異有統計學意義（F=79.96,P＜0.001），見圖5B。

圖5 支架對人成纖維細胞的趨化作用

2.6 支架對成纖維細胞遷移的影響

為了明確支架成分對細胞遷移運動的影響，評價了支架存在于基礎培養基中時人真皮成纖維細胞劃痕愈合情況。結果表明，BM-ECM/膠原蛋白支架存在于培養基中時，人真皮成纖維細胞劃痕的愈合相比單純膠原蛋白支架和無支架存在時明顯增快，見圖6A；24 h、48 h 后，BM-ECM/膠原蛋白支架作用下劃痕愈合率均高于單純膠原蛋白支架和空白組，差異有統計學意義（F=158.4,P＜0.001），見圖6B。

圖6 人成纖維細胞的劃痕傷口愈合情況

3 討論

缺乏誘導內源細胞遷移和遷入支架的調控活性是膠原蛋白支架有限促組織重建能力的關鍵原因。該研究的目的是建立一種增強膠原蛋白支架促進組織重建功能的方法，即通過引入體外培養和獲取的BM-ECM 賦予膠原蛋白支架調控細胞運動以及遷入支架的活性。研究結果表明，BMECM/膠原蛋白支架為連通多孔結構，與膠原蛋白支架相似，BM-ECM 膠原蛋白支架促進細胞運動和遷入支架的能力相比單純膠原蛋白支架顯著增強。

為提高膠原蛋白支架促進細胞遷入的功能，基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）等生物活性因子被引入支架中以增強細胞在支架中的黏附和形成聚集態［7-8］。此外，有關骨髓間充質干細胞或其外泌體提高合成支架材料促組織修復性能的研究較多［9-11］。利用骨髓間充質干細胞或其外泌體誘導內源細胞遷入膠原蛋白支架，實現支架重塑和大鼠創面愈合［12］。這些方法廣泛證實了通過引入生物活性因子改善膠原蛋白支架提高細胞遷入功能的可行性。但上述方法存在生物活性因子易失活、細胞存活率低、制備方法復雜等缺點。

BM-ECM 是以I 型膠原蛋白為主要成分且包含生長因子、趨化因子和蛋白聚糖等微量分子的混合物，因此，其提取過程簡單且易于控制，并且BM-ECM/膠原蛋白支架的制備條件簡單，具有與膠原蛋白支架相似的多孔結構。通過傅里葉紅外吸收光譜檢測糖胺聚糖的特征吸收峰能簡便、快速確證BM-ECM 的引入。制備BM-ECM/膠原蛋白支架，在提高材料生物活性的同時，有望解決復雜制備工藝的問題。

組織缺損后募集內源細胞是組織重建的基礎，利用生物材料為這些細胞提供三維空間是發揮細胞自身修復功能的基礎，其前提是細胞遷入。引入膠原蛋白支架后，BM-ECM 顯著增強內源性細胞遷入支架的能力，大部分細胞為間質細胞如ERTR7+成纖維細胞。與臨床現有合成材料相比，部分異種組織脫細胞基質如膀胱脫細胞基質［13］、小腸黏膜下層脫細胞基質［14］、羊膜脫細胞基質等組織細胞外基質具有顯著提高組織重建細胞遷入的活性［15］。組織細胞外基質來源水凝膠也顯示了對軟組織缺損修復能力以及對成血管細胞的促遷移活性［16］。BM-ECM 與上述細胞外基質在結構、組成上具有相似性［17］，除了I 型膠原蛋白，還含有糖胺聚糖、生物活性因子等調控細胞行為的生物大分子，是BM-ECM 促進成纖維細胞遷入膠原蛋白支架的關鍵成分。另外，相比通過加載生物活性因子如趨化因子和生長因子使膠原蛋白支架產生對成纖維細胞趨化活性和促進這些細胞遷入支架和促進組織新生活性的方法，本研究采用的BM-ECM 不僅制備方法簡單，是天然的生物活性分子的螯合基質，有利于提高這些分子的生物利用度，產生優異的促組織新生效果。

細胞運動是軟組織重建細胞遷入支架的關鍵過程，受到生物活性因子的調控。研究表明，細胞外基質中的纖連蛋白、血小板衍生生長因子-BB等生物活性因子的存在增強了成纖維細胞、肌細胞等細胞的趨化性和趨觸性［18-20］。BM-ECM 不僅含有血小板衍生生長因子-BB、等生物活性因子［21］，還含有基底膜蛋白多糖等蛋白糖，其能提高生物活性因子的生物利用度［22-23］，增強細胞運動和遷移能力，這可能是BM-ECM 提高膠原蛋白支架促細胞遷入功能改善的重要機制。通過引入BM-ECM 使膠原蛋白支架具有促進細胞運動和遷入的活性，其中的關鍵生物活性因子及其作用機制有待進一步研究，為BM-ECM/膠原蛋白支架的優化及其在軟組織缺損創面修復中的應用提供依據。

綜上所述，本研究建立了一種增強膠原蛋白支架促進細胞遷入活性的方法，通過引入BMECM 使膠原蛋白支架產生誘導組織重建細胞遷入支架的活性，并且顯著增強人真皮成纖維細胞的運動、遷移能力；構建的BM-ECM/膠原蛋白支架新材料具有在軟組織缺損創面修復中的應用潛力。