SASH1在胃腸道間質瘤中的表達及其臨床意義

茍志敏，袁方均

（1.錦州醫科大學國藥東風總醫院 研究生培養基地，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院 普外科，湖北 十堰 442000）

胃腸道間質瘤（GIST）是胃腸道最常見的間質來源腫瘤，占所有胃腸道腫瘤的1%～2%［1］。GIST 被認為起源于Cajal 間質細胞（ICC），胃腸道的起搏細胞。GIST 可發生在整個胃腸道的任何地方，其中約60% 發生于胃，約30% 發生于小腸，約5%發生于十二指腸，約2%發生于結腸及闌尾，約4%發生于直腸，約1%發生于食管［2］。與其他上皮來源腫瘤不同，腫瘤大小以及核分裂象是評價GIST 危險度的兩個最為重要的病理特征，但僅靠以上兩個病理特征還不能準確評價GIST 的惡性程度［3-4］。

目前普遍的認知是基因突變在惡性腫瘤發生發展中發揮主要作用，但實際上也有其他的一些因素發揮了重要的作用［5-6］，因此，筆者希望能夠發現新的生物標記物用于預測GIST 的惡性程度和臨床進程。自SASH1（SAM and SH3 domain containing 1）基因被發現以來，隨著研究的加深，發現該基因可能具有抑制腫瘤發生發展的功能，一些研究集中于其與多種實體瘤的關聯［7］。SASH1 屬于SLY 家族，包括SASH1、SLY1（淋巴細胞表達的含SH3 結構域）和SLY2（或HACS1、NASH1）。所有進化保守的SLY 家族成員都包含兩個蛋白質-蛋白質相互作用區，一個SH3（Src 同源域3）域和一個SAM（無菌α 基序）域。由于這些結構特征，SASH1 在細胞內信號轉導中發揮著重要作用；其中一個作用涉及與肌動蛋白細胞骨架相互作用和刺激細胞-基質粘附［8-10］。既往研究表明，SASH1 與腫瘤細胞侵襲和遷移的一些重要過程緊密相關。ZELLER 等［7］發現，在6 個乳腺癌細胞系中，SASH1 mRNA 的表達顯著降低或完全缺失。ZELLER 等還發現，腫瘤大小和預后與SASH1 下調程度相關，此外，在原發性甲狀腺腫瘤中也觀察到SASH1 表達顯著降低［7,11］。并且有研究發現SASH1 表達的降低或缺失與其他惡性腫瘤的侵襲性生長、轉移以及低生存率都存在相關性［12-17］。然而，SASH1 在間質細胞來源腫瘤中是否發揮著類似的作用以及SASH1 表達與GIST 患者預后之間的關系尚不清楚。本研究的目的是為了評估SASH1 在GIST 的表達，并闡明SASH1 表達與GIST 風險分類以及臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集了2017 年至2021 年間國藥東風總醫院胃腸外科共74 份患者來源的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）胃腸間質瘤組織樣本。臨床數據（包括年齡、性別、腫瘤大小、核分裂象）和其他信息均來自每位患者的醫療記錄。采用2013 版中國胃腸道間質瘤病理診斷治療共識推薦的NIH2008年改良版對腫瘤的危險度進行分級。獲得樣本的患者在手術前均未接受放療、新輔助化療或免疫治療。所有參與本研究的患者均獲得書面知情同意書。所有方法和方案均按照國藥東風總醫院的相關指南和規定執行。這項工作得到了國藥東風總醫院倫理委員會的批準。

1.2 免疫組織化學染色

脫蠟：將準備好的石蠟組織切片（3μm）置于60℃溫箱中約烘烤2 h，然后于二甲苯中脫蠟，通過分級酒精再水合，在3% 過氧化氫中浸泡15 min 以阻斷內源性過氧化物酶活性。在10 nmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中壓力蒸煮4 min，然后將載玻片與10%正常山羊血清在室溫下預孵育30 min，以減少非特異性反應。隨后，PBS 潤洗3 min×3 后滴加鼠抗人SASH1 抗體（Sigma 公司，1∶500），4℃過夜。PBS 潤洗3 min×3 后滴加Envision 二抗（GeneTech），37℃孵育30 min，最后用DAB（3,3'-二氨基聯苯胺）染色，去離子水終止顯色，蘇木素復染20 s，鹽酸酒精分化5 s；自來水沖洗15 min 返藍；中性樹脂封片。采用已知的免疫染色陽性玻片用作陽性對照。

1.3 結果判定

每張載玻片檢查五個視圖，在×400 放大率下，每個視圖觀察100 個細胞。由兩名經驗豐富的病理科醫生根據陽性細胞的分布、強度和百分比對SASH1 表達進行分級，并對每張玻片染色結果取得一致意見。SASH1 的表達通常分為四級：陰性（0%）、弱陽性（≤30%）、中等陽性（≤60%）和強陽性（＞60%）。

1.4 統計學方法

所有數據均使用SPSS 22.0 軟件進行處理。計數資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SASH1 在GIST 中的表達存在差異性

對74 例GIST 的石蠟切片進行免疫組織化學染色發現，SASH1 均表達在細胞核內，且表達量存在明顯的差異，其中33 例為高表達，而剩余41 例為低表達。見圖1。

圖1 腫瘤組織及相應正常組織中SASH1 的表達

2.2 GIST 中SASH1 的表達水平與臨床病理因素之間的關系

對SASH1 的表達強弱與GIST 的病理特征以及危險度進行相關分析顯示，SASH1 的高表達與較多的核分裂象呈負相關（r=0.404,P=0.033）；SASH1 在極低或低風險GIST 患者中的表達高于中等或高風險GIST 患者（r=0.250,P=0.028）；SASH1的表達與患者的年齡、性別、腫瘤發生部位及腫瘤大小之間均無相關性（P＞0.05）。見表1。

表1 SASH1 表達水平與GIST 的臨床病理因素的關系（例）

3 討論

胃腸間質瘤通常在生物學行為和預后方面都展現出很大的異質性和不可預測性，且大部分GIST 在完全切除后仍有復發和彌漫性生長的可能，并具有遠處轉移的能力。大約50% 的胃和非胃GIST 在腫瘤完全切除后5 年內復發。近年來，隨著醫療水平的進一步提高，通過手術切除和靶向藥物（伊馬替尼）的聯合治療大大提高了GIST 患者的生存時間，但仍有許多患者死于腫瘤的局部復發以及遠處轉移，故識別其復發轉移的危險因素極為重要。先前的研究已經提供了足夠的證據證明SASH1 代表了一種新的候選腫瘤標志物。SASH1 由兩個SAM 結構域和一個SH3 結構域組成，它們參與信號適配器蛋白或支架因子，被認為在細胞內信號轉導中起關鍵作用。SH3 結構域與富含脯氨酸的基序結合［18-19］，兩個相關蛋白質上的結合位點長度為10 個氨基酸［20］。SAM 結構域可以通過自結合或與其他蛋白質的SAM 結構域相互作用來介導蛋白質-蛋白質相互作用［21-22］。SAM 結構域還可以介導Smaug 蛋白和mRNA 之間的結合，以調節轉錄［23］。鑒于上述發現，SASH1被認為會影響腫瘤的侵襲和轉移，這種推測已在評 估U251 膠質瘤細胞［24］、A549 人肺腺癌細胞［17］、A-375 黑色素瘤細胞［25］和MG-63 骨肉瘤細胞［26］的研究中得到證實。然而，這些研究都沒有研究SASH1 在GIST 中表達的相關臨床意義。

在這項研究中，筆者使用免疫組化方法檢測了GIST 樣本以及相應的正常組織中SASH1 蛋白的表達。發現SASH1 在腫瘤中的表達低于相應鄰近正常組織和手術切緣的表達，在GIST 中，低SASH1 表達與患者的風險分級具有相關性，且隨著腫瘤的惡性程度進一步提高，SASH1 表達顯著降低。與前人研究中使用的方法相比，筆者在實驗和分析中使用的方法有兩個優點：首先，TMA的使用允許對所有樣本進行統一評估，從而能夠創建用于評估不同組織中染色強度和陽性細胞百分比的可比標準；其次，使用大樣本GIST 患者進行分析可以提高相對可信度。但本研究仍有局限性，由于主要采用回顧性觀察，因此結果可能缺乏普遍適用性，這需要進一步研究SASH1 的確切功能，如構建質粒，以證實筆者的發現和假設：GIST 中SASH1 表達降低預示著預后不良。

綜上所述，筆者認為SASH1 可以被視為一種新的生物標記物和一個有希望的GIST 治療靶點。