利用洛南廢次煙葉提取茄尼醇的工藝研究

孫 楠，任有良，孫強強，王毅夢

(商洛學院 化學工程與現代材料學院/陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室，陜西 商洛 726000)

陜西省商洛市洛南縣是國家確定的首批整縣推進的現代煙草農業示范縣，年平均種植烤煙0.67萬hm2，“十三五”期間，洛南縣烤煙面積要穩定在0.67萬hm2。由于煙葉生產標準提高，產生了大量的殘次煙葉以及煙，焚燒產生大量的煙塵霧霾，破壞大氣環境，還污染土壤，對烤煙生產持續發展產生不利影響，因此，利用廢次煙葉生產茄尼醇、煙堿、活性炭及有機肥[1～4]，有利于保護環境、烤煙生產可持續發展，增加煙農收入，精準扶貧。目前，茄尼醇主要應用于合成維生素K2和輔酶Q10，其中輔酶Q10的合成最具有應用和商業價值[5～8]。輔酶Q10具有改善心肌代謝障礙的作用，是細胞內產生能量所必不可少的輔酶助因子，作為人體細胞呼吸和代謝的激活劑以及機體的免疫增強劑，用于治療急慢性肝炎、亞急性肝壞死、心腦血管等疾病[8～10]。雖現有不少企業在生產茄尼醇，但因生產技術落后，工藝陳舊，產品質量不穩定，生產成本高，經濟效益低而無市場競爭力[11～14]。這些低含量的的茄尼醇不能直接作為藥用原料，導致我國粗品茄尼醇出口到日美等國家后，被精制加工成含量以上精品茄尼醇萬元噸或合成輔酶Q10后再返銷國內[15～17]。筆者研究廢次煙葉中茄尼醇的提取純化新工藝，改進傳統的提取技術，獲取高收率和高質量的茄尼醇產品，使之符合現代醫藥生產和產品的要求，力求在提高茄尼醇產品質量、降低生產成本、充分利用資源等方面有所改進或突破。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

廢次煙葉，2019年3月采摘于陜西省商洛市洛南縣；茄尼醇標準品，四川省維克奇生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析純)，天津市津東天正精細化學試劑廠；石油醚(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司；羧甲基纖維素鈉(分析純)，天津市河東區紅巖試劑廠；薄層層析硅膠G(分析純)，青島海洋化工有限公司；冰乙酸(分析純)，天津市百世化工有限公司。

數顯式電熱恒溫水浴鍋(HHS-11-1型)； 旋轉蒸發儀(220V 50/60Hz型)； 小型樣品粉碎機(SA-10型)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 煙草原料預處理 將清洗過的煙葉置于烘箱中在60℃下烘3 h，粉碎，置于密封袋中備用。

1.2.2 茄尼醇粗提方法 精確稱取預先處理過的樣品10g置于250mL平底燒瓶中，以固液比1∶10的比例加入100 mL的石油醚溶劑，將燒瓶置于數顯式電熱恒溫水浴鍋發生裝置中，在50℃下提取6h后取后進行抽濾。濾液通過旋轉蒸發儀濃縮除去有機溶劑后，剩余物即為煙草茄尼醇粗提物。

1.2.3 茄尼醇粗提物的皂化 稱取一定量茄尼醇粗提物于250 mL平底燒瓶中，加入50 mL 0.2 mol/L NaOH乙醇溶液，在50℃下皂化反應2 h，停止反應，旋轉蒸發除去乙醇得褐色粘稠物，再向燒瓶中加入50 mL蒸餾水，加熱攪拌并滴加鹽酸調節pH=7，再用石油醚萃取3次(50 mL×3)，合并石油醚層，用蒸餾水反洗一次，旋轉蒸發石油醚萃取液得茄尼醇純品。

1.2.4 茄尼醇定性測定 用薄層色譜法來定性測定廢次煙葉皂化后的樣品中茄尼醇的存在。用石油醚溶解茄尼醇標準樣和測試樣，配置成一定濃度的試液，在一塊硅膠層析板上同時用毛細管點上標準樣和測試樣，然后將層析板置于展開溶劑中展開，展開溶劑不要沒過硅膠層析板下端10 mm處，待展開溶劑前沿達到五分之四處時取出層析板，待溶劑揮發后用碘蒸氣顯色。

固定相： 預制硅膠板

流動性(展開劑)： 石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸=4∶1∶0.5

顯色劑： 碘蒸氣

展開方式： 平行展開

1.2.5 茄尼醇定量測定 稱取茄尼醇標準品0.020 g，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容得0.4 g/L茄尼醇標準品溶液。分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的茄尼醇標準品溶液于10 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混勻，制備成一系列質量濃度的茄尼醇標準品溶液，于210 nm波長下采用紫外-可見分光光度計法測其吸光度。

2 結果與討論

2.1 定性分析

茄尼醇薄層色譜結果如圖1所示：

Rf=溶質移動的距離/溶液移動的距離

左邊是茄尼醇標準品，右邊是樣品茄尼醇提取液，經計算，茄尼醇標準品Rf=0.68，樣品提取液Rf=0.676 0，樣品與標準樣的Rf值的數據相符，確定提取出的產品為茄尼醇。如圖1所示：

圖1 薄層色譜

2.2 定量分析

根據茄尼醇定量測定的方法，將吸光度(A)與質量濃度(c)回歸得標準品茄尼醇在95%乙醇中的線性方程為:

A=7.164 3c+0.625 8 R2=0.996 4 如圖2所示。

在提取的茄尼醇樣品中加入95%乙醇定容至50 mL容量瓶中，用紫外分光光度計測定其吸光度，根據茄尼醇標準品的標準曲線回歸方程算出茄尼醇粗品的質量，進而得出茄尼醇的提取率。

茄尼醇提取率=茄尼醇質量/煙草原料質量×100%

2.3 提取茄尼醇的影響因素

2.3.1 浸提溶劑對提取率的影響 溶劑篩選試驗提取條件為溫度50 ℃，時間6 h， 料液比1∶10(g/mL)，篩選溶劑分別為石油醚，丙酮，乙醇，乙酸乙酯，篩選指標為茄尼醇提取率和溶劑價格。

圖2 茄尼醇標準品標準曲線

不同溶劑對茄尼醇的提取率如表1所示。

表1 不同溶劑對茄尼醇的提取率

從表1可以看出，石油醚的提取效果最好，乙酸乙酯和無水乙醇的提取效率沒有石油醚的好，其原因是因為茄尼醇的極性較小，根據相似相容原理，茄尼醇在低極性的溶劑石油醚中溶解度比在高極性的無水乙醇和乙酸乙酯中溶解度大，因此應選極性小的石油醚作為提取溶劑，從溶劑成本上考慮，石油醚作為提取溶劑更合適。所以最佳浸提溶劑為石油醚。

2.3.2 浸提溫度對提取率的影響 實驗條件為浸提溶劑石油醚，浸提時間6 h，料液比1∶10，提取溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，浸提溫度對提取率的影響如3所示：

圖3 浸提溫度對提取率的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，茄尼醇的提取率在50℃達到最大。因為在較高的提取溫度下有利于植物細胞膜、細胞壁和纖維結構的破壞，且樣品的顆粒越小這種破壞程度會增強，所以，提取溫度的升高，不僅有助于細胞膜、細胞壁和纖維結構的繼續破壞，而且還增大了茄尼醇在石油醚中的溶解度和分子的運動速度，在濃差化學勢的作用下使茄尼醇繼續釋放出來，使得茄尼醇提取率隨之相應增加。但當溫度高于50℃后，會引起茄尼醇分子的衰變，從而降低茄尼醇的提取率。因此茄尼醇的最佳浸提溫度為50℃。

2.3.3 浸提時間對提取率的影響 實驗條件為浸提溶劑石油醚，浸提溫度50℃，料液比1∶10，篩選浸提時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，如圖4所示：

圖4可知，提取時間低于6 h 時，提取率的增長很快，因為煙葉的細胞膜、細胞壁和纖維結構的破壞需要適當的溫度，還需要時間去降低提取液的擴散阻力，在濃差化學勢的作用下，逐漸提取出煙葉細胞壁中的茄尼醇。隨著提取時間的增長，細胞膜、細胞壁和纖維結構被大部分破壞，茄尼醇的提取率隨著提取液的擴散速度增大也快速增大。當提取時間超過6h后，細胞膜、細胞壁和纖維結構被破壞掉，進到提取液中茄尼醇的量也越來越多，但提取液和煙葉細胞中茄尼醇的濃差化學勢作用逐漸減小，茄尼醇提取率增長速度逐漸減小，因而茄尼醇提取率隨時間的延長變化緩慢。所以茄尼醇的最佳提取時間是6 h。

圖4 浸提時間對提取率的影響

2.3.4 料液比對提取率的影響 實驗條件為浸提溶劑石油醚，浸提溫度50℃，浸提時間6 h，篩選料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，如圖5所示：

圖5 料液比對提取率的影響

由圖5看出，隨著料液比的增大，茄尼醇的提取率也增大，在料液比為1∶10時達到最大，之后，隨著料液比的增大，雖然提取率在增大，但增長速度很慢。當提取液較少時，隨著溶出的茄尼醇，很快在提取液中達到分配平衡，這樣煙葉中可提取的茄尼醇不能充分進入到提取液中被提取，從而降低提取率。要溶出更多的茄尼醇才能使茄尼醇在煙葉和提取液間達到分配平衡，這時兩相中的滲透壓也相應增大，使越來越多的茄尼醇進入到提取液中，則提取率逐漸增大。當料液比達到1∶10時，一方面，煙葉中茄尼醇含量很低，另一方面，提取液含量過大，這時，從煙葉溶出少量的茄尼醇很快達到分配平衡，而提取液中茄尼醇濃度無明顯變化，所以提取率幾乎沒有明顯增加。所以提取茄尼醇最佳料液比為1∶10。

3 結論

(1)利用洛南廢次煙葉煙桿提取茄尼醇的工藝研究路線：先將廢次煙葉洗凈、粉碎、烘干，通過加入有機溶劑浸提一定時間，旋轉蒸發除去有機溶劑，得到粗提物，進行皂化，旋轉蒸發除去皂化液，加蒸餾水，調節pH，萃取，洗滌，再次旋轉蒸發，得到皂化物，最后對產品鑒定。

(2)經薄層色譜法測定，測試樣的Rf值是0.676，與標準樣的Rf值0.68的數據相符，確定提取出的產品為茄尼醇。

(3)通過試驗最終得出：采用溶劑法浸提煙葉中茄尼醇的最佳提取工藝條件：浸提液為石油醚，料液比為 1∶10，提取溫度為50℃，提取時間為6 h。在此條件下，經過紫外分光光度計法定量測定，煙葉中茄尼醇的提取率為0.10%。