絞股藍總黃酮的提取工藝及抑菌性質

張亦琳，延 永，張 琴

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

絞股藍[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino]為葫蘆科植物的全草，又名小苦葉、七葉膽等，味苦、微甘，性涼，具有清熱、補虛、解毒的功效，有“第二人參”和“南方人參”之稱，對治療病毒性肝炎、慢性支氣管炎、體虛乏力等癥有確切的療效[1,2]。衛健委(原衛計委)將其列為保健食品的中藥，常被制成保健茶、飲料、食品添加劑等功能性食品[3]。絞股藍在陜西商南地區廣泛種植，陜西省政府在《陜西省道地中藥材志》中將絞股藍確定為重點中藥材品種[4]。絞股藍總提取物成分復雜，包含多糖、皂苷[5, 6]、黃酮[7]等，其中總黃酮含量約3%～5%[8]，主要有商陸素、蘆丁、槲皮素及蕓香苷等十余種[9]。提取方法有常規溶劑回流法、超聲輔助提取、微波輔助提取等[10]，很少有人考慮浸泡對提取效果的影響。研究表明，植物浸泡后有助于提取有效成分，提高提取得率[11]。

為提升絞股藍藥材資源利用率，提高產品效價，以陜西道地藥食兩用的中藥材絞股藍為研究對象，在回流提取絞股藍中總黃酮的工藝的基礎上，增加溶劑浸泡，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面法，優化絞股藍總黃酮的提取工藝，并對絞股藍總黃酮提取物的抑菌活性進行研究，為絞股藍總黃酮提取工藝開發提供新的思路，對絞股藍功能產品開發提供了理論基礎。

1 儀器與試劑

UV-255型紫外分光光度計(大連市儀器制造公司)、ZYMICRO-I-10T型超純水機(成都鼎越水處理設備有限公司)、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)

絞股藍(商洛本地產，購于商洛市怡康大藥房)、蘆丁標準品(南京道斯夫生物科技有限公司)；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 標準曲線繪制

蘆丁標準品溶液的制備參考文獻方法[12]：配置質量濃度分別為0、0.0040、0.0080、0.0120、0.0160、0.0200、0.0240 mg/mL的蘆丁標準品稀釋液，測定吸光度值(A)。以蘆丁標準品溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為Y=9.9431X+0.00231(R2=0.99718)。

2.2 總黃酮含量的測定

取一定量的提取液，按蘆丁標準品溶液的方法處理后于510 nm處測定吸光度(A)，通過標準曲線方程計算絞股藍總黃酮濃度，由下式計算提取率Y(%)。

其中，C(g/mL)為提取液質量濃度；N為稀釋倍數；V為提取液體積(mL)；W為藥材總質量(g)。

2.3 單因素試驗

稱取絞股藍5 g，以乙醇濃度為70%，溶劑體積50 mL，浸泡時間30 min，提取溫度70℃，提取時間120 min為基礎提取條件，調整乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇濃度對提取的影響；調整溶液體積分別為12.5 mL、25 mL、50 mL、75 mL和100 mL，考察料液比對提取的影響；調整浸泡時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，考察浸泡時間對提取的影響；調整提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，考察提取溫度對提取的影響；調整提取時間分別為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min考察提取時間對提取的影響。

2.4 Box-Behnken響應面試驗設計

基于單因素試驗結果，以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為自變量，用-1、0、1分別表示自變量的高低水平，以總黃酮提取率為評價指標，設計三因素響應曲面試驗，因素與水平如表1所示。

表1 因素和水平

2.5 驗證性試驗

為了驗證響應面優化結果的可靠性，對預測的最佳提取條件進行驗證，確定與預測值的吻合程度。如果與預測值基本吻合，說明預測模型與實際情況擬合較好，反之則擬合失敗。

2.6 絞股藍總黃酮提取物抑菌活性測定

在滅菌環境下，將100.0 μL菌種種植在瓊脂培養基內，密封，搖勻，置于培養箱中18 h(37℃)。取濾紙片(滅菌，d=7.00 nm)蘸取高、中、低劑量物溶液和安息香酸鈉溶液后(濃度見表4)，將其密封在涂有菌懸液的培養基，在37℃條件下培養18 h，計算抑菌率W(%)。

其中：A為測試液抑菌圈直徑/mm；B為安息香酸鈉抑菌圈直徑/mm；d為濾紙片直徑/mm。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇濃度對絞股藍總黃酮提取的影響 由圖1可知，因乙醇滲透能力較強，提高乙醇濃度能加速目標成分在提取液和細胞基質之間的溶解平衡，所以隨乙醇濃度的增大，絞股藍總黃酮含量逐漸上升；當乙醇濃度達到80%時，總黃酮的含量達到最大值。但是，由于黃酮類化合物極性較大，根據相似相溶原理，繼續升高乙醇濃度，總黃酮溶解度降低。因此，選用乙醇濃度在60%、70%、80%三個水平進行響應面試驗。

圖1 乙醇濃度對絞股藍總黃酮提取的影響

3.1.2 料液比對絞股藍總黃酮提取的影響 由圖2可知，隨著料液比的增大，絞股藍總黃酮的提取率也逐漸減大，當料液比為1∶10時，總黃酮提取率達到3.47%。繼續增大料液比，絞股藍總黃酮提取率逐漸減小，可能是由于隨著液料比減小，絞股藍樣品的其他成分也隨之溶出，影響了黃酮類化合物的溶解度。因此，選擇料液比1∶5、1∶10、1∶15三個水平進行響應面試驗。

圖2 料液比對絞股藍總黃酮提取率的影響

3.1.3 浸泡時間對絞股藍總黃酮提取的影響 如圖3所示，溶劑浸泡有利于中藥活性成分的析出，隨著浸泡時間的增長，絞股藍總黃酮提取率有明顯增加，當浸泡時間達到30 min時，提取率達到最大值3.23%，繼續增加浸泡時間，提取率基本不再增加，從時間成本和提取效率上考慮，選擇浸泡時間為30 min，不做響應面研究。

3.1.4 提取溫度對絞股藍總黃酮提取的影響 由圖4可知，當提取溫度不斷升高時，絞股藍總黃酮的含量也隨著升高，當提取溫度達到60℃時，總黃酮提取率最大值為3.31%。繼續升高提取溫度，總黃酮提取率出現下降趨勢，可能由于隨著提取溫度的升高，絞股藍中的氨基酸、多糖等的溶出影響了黃酮類化合物的析出(提取液變黑，有少量黑色沉淀出現)。因此，選擇提取溫度為50℃、60℃、70℃三個水平進行響應面實驗。

圖3 浸泡時間對絞股藍總黃酮提取率的影響

圖4 提取溫度對絞股藍總黃酮提取率的影響

3.1.5 提取時間對絞股藍總黃酮提取的影響 由圖5可知，在提取時間少于120 min時，總黃酮提取率隨著提取時間的增加而增大，且增大的趨勢增強，當提取時間達到120 min時，絞股藍總黃酮提取率達到最大值，繼續延長提取時間，提取率變化不大。因此，選擇120 min作為絞股藍總黃酮的提取時間，不做響應面優化。

圖5 提取時間對絞股藍總黃酮提取的影響

3.2 響應面試驗結果與分析

3.2.1 響應面試驗方案及試驗結果 以A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取溫度)作為考察因素，絞股藍總黃酮的提取率為響應值，利用Design-Expert8.0.6Trial 軟件對數據進行多元回歸分析，結果見表2，并建立參數回歸模型。

表2 試驗設計方案及結果

模擬回歸方程為：總黃酮提取率= 0.37-7.125×10-3A-0.012B+0.013C-0.019AB +1.200×10-3AC+7.825×10-3BC-0.053A2-0.13B2-0.099C2

3.2.3 響應面各因素交互作用分析 使用Design-Expert8.0.6Trial 軟件對絞股藍總黃酮的提取工藝的相關因素做出響應面曲線圖。如圖6a、6b、6c可見，AB、AC、BC三個3D相應曲面曲線陡峭，說明各因素對總黃酮含量影響較顯著，當變量發生變化時能對絞股藍總的提取影響明顯如圖6d、6e、6f可見，AB、AC、BC三個等高線圖呈現明顯的橢圓形，尤其是乙醇濃度和提取溫度、乙醇濃度和料液比交互作用較強。

表3 方差分析

圖6 兩因素交互作用對總黃酮得率的響應面圖和等高線

3.2.4 最佳提取條件的確定 根據Design-Expert8.0.6Trial 軟件模擬模型，分析最佳的提取工藝為：乙醇濃度79.75%，提取溫度59.40℃，料液比1∶10.13，預測最佳工藝的總黃酮的提取率為3.71%。

3.2.5 總黃酮驗證性實驗 充分考慮實驗的可行性，將預測的最佳工藝調整為乙醇濃度80.0%，提取溫度59.40℃，料液比1∶10.10，浸泡時間30 min，回流時間120 min。平行3次驗證，總黃酮提取率分別為3.84%、3.77%、3.79%，平均值為3.80%(RSD=94.88%)，與預測值相符。驗證實驗證明該工藝具有穩定性。

3.3 絞股藍總黃酮提取物體外抑菌活性測試結果

絞股藍總黃酮提取物對8種測試菌均有抑菌效果，如表4所示：

表4 不同濃度絞股藍提取物對不同菌種的抑菌作用

結果表明，絞股藍總黃酮提取物對8種測試菌的抑菌活性與提取物濃度關系密切，隨著總黃酮的濃度增加，抑菌圈直徑變大。高劑量時對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制率可媲美安息香酸鈉(3.28 mg/mL)，抑制率分別增加103.30%和98.61%；對肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌的抑制效果相對較差，抑制率不超過50%。

4 結論與討論

本工藝新增考慮溶劑浸泡對絞股藍總黃酮提取的影響，通過Box-Behnken設計中的響應面優化試驗，成功優化得到絞股藍總黃酮提取的最佳工藝為：乙醇濃度80.0%，提取溫度59.40℃，料液比1∶10.10，浸泡時間30 min，回流時間120 min，絞股藍總黃酮的提取率的平均值為3.80%(RSD=94.88%)。絞股藍提取過程中，乙醇濃度對提取的影響較為顯著，與之前文獻報道一致，這也是絞股藍提取物大部分為醇提物的原因，經驗證，總黃酮提取物的成分較為復雜，另一種有效成分的絞股藍皂苷的含量達到2.6123 mg/mL，后續研究重點應該在提取物有效成分的分離和純化，相關研究工作已經啟動。

抑菌實驗表明：絞股藍總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌8種測試菌均有抑制活性，尤其是高劑量提取物對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制率可媲美安息香酸鈉(3.28 mg/mL)，抑制率分別增加103.30%和98.61%；因此，我們有理由認為絞股藍的總黃酮提取物具有較好的實用價值，開發提取工藝和研究提取物的生物活性具有一定的實際意義。