基于“既病防變”理論研究消潰湯調控IL-6/STAT3信號通路抑制潰瘍性結腸炎癌變的作用機制*

王芳增，盧玉陽，楊會舉，劉佃溫

(1.濮陽市第三人民醫院，河南 濮陽 457000；2.河南中醫藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046；3.河南中醫藥大學第三附屬醫院肛腸科，河南 鄭州 450008)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因復雜、機制不明、以結直腸反復炎癥性病變為主的疾病[1]。其臨床表現以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主，腸外癥狀為輔，反復發作，病程遷延，伴有癌變的風險[2-3]。潰瘍性結腸炎發病率有逐年增高的趨勢，在潰瘍性結腸炎中結腸癌的發病率為3%～5%。隨著患病時間的延長，發生結腸癌的危險性也逐年增加，≥10年者的發生率是普通人的10倍以上[4]。《素問·四氣調神大論篇》曰：“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂。”意即未病先防與既病防變：在未患病時采取有效措施，扶助正氣，去除病因，使疾病不能顯現；患病之后，采取有效措施進行早期診斷和治療，截斷疾病的發展和傳變，并阻止疾病預后復發，鞏固療效[5]。消潰湯是劉佃溫教授自擬方。本課題組經過長期臨床觀察發現，消潰湯治療UC療效確切，能明顯改善患者臨床癥狀；同時前期研究[6]表明，消潰湯能阻斷大鼠UC病程進展，修復受損黏膜，改善癥狀。方中白頭翁入大腸經，清熱解毒，涼血止痢，為君藥。白及收斂止血，消腫生肌，為臣藥。佐以石榴皮、五倍子澀腸止瀉，收斂止血；黃連、苦參清大腸之濕熱，祛大腸之濁毒。白蒺藜活血祛風使大腸得以濡養，為使藥。全方共奏清熱解毒滲濕、澀腸止血之效。本研究通過建立大鼠UC模型，基于“既病防變”理論觀察消潰湯對于白細胞介素(IL)-6/轉錄激活因子(STAT3)信號通路的調控作用，探究其抑制潰瘍性結腸炎癌變的相關機制，旨在為UC的臨床治療提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

4～5周齡SD大鼠60只，雄性，體質量(200±20)g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號為SCXK(豫)2017-0001，動物質量合格證號41003100001868。飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心，實驗室使用許可證編號SYXK(豫)2010-0001。環境相對濕度40%～60%，室溫20～22 ℃，每日光照12 h。飼養在塑料籠內，每籠大鼠不多于3只，自由飲水、攝食，常規飼養7 d以適應環境。

1.2 藥品、試劑與儀器

消潰湯藥物組成：白頭翁20 g，石榴皮15 g，白及20 g，五倍子15 g，白蒺藜10 g，黃連15 g，苦參15 g。藥材由河南中醫藥大學第三附屬醫院中藥房提供。參照徐叔云教授主編的《中藥藥理實驗方法學》大鼠和人之間按照體表面積折算出來的等效劑量比值換算，動物實驗中的治療組按成人劑量的7倍為有效劑量。成人體質量以60 kg計算，臨床用藥量為110 g/d，給藥劑量為1.83 g/kg；大鼠給藥量為10倍計算，即給藥劑量為18.3 g/kg。煎煮方法：先將以上藥物置于干凈的玻璃杯中，加入蒸餾水500 mL浸泡 2 h；于100 ℃煎煮30 min，過濾藥渣得濾液約300 mL；將藥渣再加入蒸餾水400 mL，同法煎煮，得濾液約300 mL；合并兩次濾液濃縮成60 mL(生藥含量1.83 g/mL)，置4 °C冰箱保存，備用。美沙拉嗪緩釋顆粒劑，愛的發制藥公司產品，注冊證號H20100063，0.5 g/袋，用生理鹽水配制成0.1 g/mL的混懸液，于4 ℃冰箱中備用。以成人每天4 g臨床用藥量、體質量60 kg計，用藥劑量為0.07 g/kg；大鼠給藥劑量按成人臨床用量的10倍計算，即0.7g/kg體質量。Trizol，賽默飛世爾公司產品，批號15596-026；HiScript Reverse Transcriptase(RNaseH)、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye2、SYBR Green Master Mix，均為諾唯贊公司產品，批號為101-01/02、101-01/02、111-02、111-02；ddH2O(DNase/RNase Free)，復能基因公司產品，批號C1D230A；Ribonuclease Inhibitor，北京全式金公司產品，批號LOT#J11202；dNTP，天根生化科技公司產品，批號LOT#P4325；Taq Plus DNA Polymerase和DL2000 DNA Marker，均為天根生化科技公司產品，批號T105-01、MD114-02；Random Primer(N6)，北京艾德萊生物科技公司產品，批號271830AH；三硝基苯磺酸，西格瑪奧德里奇公司產品，批號P2297；大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠IL-10 ELISA試劑盒，均為武漢基因美生物科技公司產品，批號13314128222、13814124222。E200型光學顯微鏡，日本尼康公司產品；QuantStudio6實時熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司產品；Nano-100型微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司產品；EDC-810型PCR儀，東勝創新生物科技有限公司產品；JY02S型紫外分析儀，北京君意東方電泳設備有限公司產品；KD-BMII型石蠟切片機，德國徠卡產品；H1650-W離心機，德國艾本德公司產品。

1.3 模型的建立與分組

隨機選取15只大鼠作為正常組，不予造模；將剩余45只大鼠采用TNBS灌腸方法制備UC模型[7]。造模后每日觀察記錄大鼠飲食、體質量、活動量等一般情況，詳細記錄其大便性狀及肛周污物情況。參照參考文獻[8]，擬定UC模型大鼠診斷標準：①便溏或伴有膿血；②體質量下降，食欲不振；③精神萎靡，毛發枯萎；④弓背、活動減少；⑤腸黏膜組織病理學檢查見黏膜層及黏膜下層炎癥浸潤、潰瘍形成。具備上述條件則表明造模成功。造模期間死亡4只，考慮死因為藥物毒性不耐受。7 d后造模結束，將宏觀癥狀不符合標準的2只排除[9]。在余下39只中隨機取3只處死，解剖結腸組織確定造模成功。將剩余的36只大鼠隨機分為模型組、消潰湯組、美沙拉嗪組3組，每組12只。

1.4 給藥方法

造模成功 24 h 后開始給藥。消潰湯組給予消潰湯煎劑18.3 g/kg體質量，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液0.7 g/kg體質量，模型組及正常組灌胃生理鹽水，灌胃容積均為2 mL，1次/d，持續14 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 樣本采集

末次給藥后24 h，以100 g/L水合氯醛按3 μL/g體質量行腹腔注射麻醉，取材。①腹主動脈采血5 mL，于肝素抗凝管中靜置5 min，以離心半徑13.5 cm、轉速3 000 r/min 離心15 min，取血清置入EP管，凍存-80 ℃冰箱，用于ELISA檢測IL-10、IL-6。②采血后,取肛門以上2～12 cm腸段，4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干；剪開腸管，肉眼觀察腸黏膜并記錄結果。此外，取一塊約1 cm病變結腸，40 g/L多聚甲醛固定，脫水、透明后石蠟包埋，制成4 μm切片，顯微鏡下觀察組織學變化。③取1 g新鮮結腸組織于-80 ℃冰箱中冰凍保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)測定IL-6 mRNA、Janus激酶2(JAK2)mRNA、STAT3 mRNA和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)mRNA相對表達量。

1.5.2 一般情況

每天灌胃前觀察大鼠的活動、飲食飲水、毛發光澤、精神狀態。

1.5.3 疾病活動指數(DAI)評分

給藥的第1、14天稱量體質量，觀察大便性狀，檢測潛血情況，進行DAI評分[10]。計分標準：體質量無下降、下降1%～15%、下降>15%各計0、2、4分；大便正常、半稀便、稀便各計0、2、4分；大便潛血陰性、潛血陽性、肉眼血便各計0、2、4分。DAI評分=體質量下降評分+大便性狀評分+便血評分

1.5.4 結腸黏膜損傷指數(CMDI)評分

取整個結腸組織，剪開標本、沖洗大便，腸黏膜層向上展開，平鋪在濾紙上，用大頭針兩端固定，浸沒在生理鹽水中，肉眼觀察黏膜損傷程度。按以下標準[11]進行評分。無損傷，計0分；局部充血、水腫但未出現潰瘍，計1分；有潰瘍，但沒有明顯炎癥，計2分；有潰瘍，僅有一處出現炎癥，計3分；有多處潰瘍和炎癥，潰瘍大小l cm，計5分。

1.5.5 結腸組織損傷指數(TDI)評分

采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察大鼠結腸組織病理變化。取石蠟切片，60 ℃烤片2h，常規脫蠟、水化，置于蘇木素染液內，鹽酸乙醇進行分化，流水沖洗，采用伊紅染液處理2 min復染，蒸餾水沖洗充分去除染液，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。采用以下標準[12]進行相關評分：正常黏膜，計0分；基底隱窩缺損1/3，計1分；基底隱窩缺損2/3，計2分；隱窩缺失，僅余表面上皮，伴炎細胞浸潤，計3分；黏膜糜爛、潰瘍伴大量炎細胞浸潤，計4分。

1.5.6 血清IL-10、IL-6水平

按照試劑盒說明書檢測。

1.5.7 結腸IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA水平

采用Trizol法提取RNA，將干燥RNA沉淀溶于20 μL DEPC水中。利用分光光度計檢驗RNA純度及濃度是否合格。將總RNA放于-80 ℃冰箱內保存以備用。

①反轉錄。反應體系總體積20 μL：2 μL RNA，1 μL Oligo(dT)Primer，4 μL dNTP，4 μL 5×Hiscript Buffer，1 μL Hiscript Reverse Transcriptase，0.5 μL Ribonuclease Inhibitor，用無核糖核酸酶的去離子水補足至20 μL。反應條件設置為：25 ℃反應5 min，50 ℃反應15 min，85 ℃反應5 min，4 ℃反應10 min。

定量PCR。反應體系總體積20 mL,其中4 μL cDNA(已稀釋3倍)，0.4 μL的Forward Primer(10 μmol/L)和0.4 μL Reverse Primer(10 μmol/L)，10 μL SYBR Green Master Mix，0.4 μL 50×ROX Reference Dye 2，4.8 μL ddH2O(Rnasefree)。反應條件設置為：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。運用2-△△CT法計算相對表達量。引物由北京博邁德生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

正常組：從實驗開始到結束，大鼠體質量穩步増長，精神狀況良好，毛發光亮，進食水量正常，敏捷活潑，無便血及黏液，無腹瀉及黏液膿血便，無死亡。模型組：造模開始當天即出現腹瀉；后逐漸出現黏液膿血便、毛發欠光澤、活動度減少、進食量減少、體質量下降等表現，肛門周圍沾有污物；2周后大鼠大便次數進一步增多，多呈黏液膿血便，大鼠肛周污物呈暗紅色。灌胃期間大鼠無死亡。消潰湯組、美沙拉嗪組：造模后表現同模型組。灌胃給藥2周后，大便逐漸正常，精神好轉，活動量増多，毛發逐漸光澤，大便成形、無黏液膿血、無惡臭，肛周變清潔，飲水量增加，體質量回升。

2.2 各組大鼠DAI評分對比

給藥第1天，與正常組對比，模型組、消潰湯組和美沙拉嗪組DAI評分增高，差異有統計學意義(P<0.05)。給藥第14天，與模型組對比，消潰湯組和美沙拉嗪組的DAI評分均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；消潰湯組和美沙拉嗪組之間DAI評分對比，差異無統計學意義(P>0.05)；與正常組對比，其余3組的DAI評分仍然偏高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠DAI評分對比 分，

2.3 各組大鼠結腸組織病理學形態、CMDI評分 和TDI評分對比

正常組：大鼠結腸黏膜組織表面光滑完整，未見充血，潰瘍形成；光鏡下腺體分布規則，可見少量炎性細胞浸潤。模型組：大鼠結腸黏膜表面充血水腫，伴壞死及潰瘍形成，達結腸肌層；光鏡下可見大量炎性細胞浸潤，肌層結構紊亂，杯狀細胞減少，隱窩膿腫形成，黏膜損傷指數顯著增高。消潰湯組和美沙拉嗪組：結腸黏膜表面潰瘍基本愈合，伴有散在黏膜糜爛點；光鏡下可見中等量炎性細胞浸潤，肌層結構較清晰，損傷指數較模型對照組均顯著降低。見圖1。

與正常組對比，模型組CMDI評分、TDI評分均增高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，消潰湯組和美沙拉嗪組的CMDI評分、TDI評分均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。消潰湯組和美沙拉嗪組之間2個指標對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠CMDI評分、TDI對比 分，

2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-10水平對比

與正常組對比，模型組大鼠血清IL-6升高、IL-10降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比,消潰湯組和美沙拉嗪組IL-6降低、IL-10增高，差異有統計學意義(P<0.05)。消潰湯組和美沙拉嗪組之間2個指標對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-10水平對比

2.5 各組大鼠結腸組織IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA水平對比

與正常組對比，模型組、美沙拉嗪組和消潰湯組大鼠結腸組織中IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，消潰湯組和美沙拉嗪組大鼠結腸組織中的IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。消潰湯組和美沙拉嗪組之間各指標對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠結腸組織IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、HIF-1α mRNA水平對比

3 討 論

近年來UC發病率逐年增高，隨著病程的延長結腸癌變的風險明顯增加[13]。UC是由多種因素引起的，包括遺傳易感性、環境因素、吸煙、飲食因素、腸道微生物群和免疫系統功能的變化[14]。UC屬中醫學“腸澼”“痢疾”“腸風”等范疇。濁毒是該病發生發展的關鍵，是UC的病程進展中病因和病理的統一。UC病因初為濕盛，濕盛化濁，濁久為痰，濕、濁、痰三者郁久化熱，熱之極為毒，終而形成濁毒[15]。其壅滯臟腑阻礙傳化糟粕的功能，壅滯經絡損傷大腸脂膜血絡，導致局部氣血郁結，日久化熱，瘀血化為膿血。消潰湯由白頭翁、白及、石榴皮、五倍子、白蒺藜、黃連、苦參組成，具有清熱解毒、化濁收斂的功效。現代藥理學研究證明，其組方中各單味藥材具有抗炎、抗腫瘤作用[16-20]。本研究證實了消潰湯治療UC的有效性。結果表明，消潰湯具有抑制炎癥反應、改善腸道功能及恢復腸道生理結構的作用。

以往研究[21-22]發現：炎癥或感染部位是結腸癌等腫瘤的高發部位，細胞突變概率的增加與炎癥環境相關；炎癥可通過破壞機體免疫，進而減弱相關療法對癌癥的治療作用。研究[23-24]表明：促炎癥細胞因子IL-6能通過STAT3信號通路誘導相關基因的表達，進而調控細胞增殖和凋亡，參與機體炎癥反應；同時，一定程度阻斷該通路能夠對癌細胞的增殖和轉移發揮抑制作用，此種效應可能通過阻斷通路傳導進而調控下游相關基因表達實現。實驗[25]證明，抗炎藥物能降低各種癌癥的發生風險，長期使用可有效降低結腸癌發生風險、死亡風險，減小腫瘤體積。由此可推斷，炎癥反應對腫瘤的發展有一定的促進作用。

生理狀態下，結腸黏膜的損傷與修復處于動態平衡之中。當黏膜的防御和修復能力低于損傷因素或炎癥攻擊時，機體動態平衡被打破，病理狀態發生。IL-6是多效性細胞因子，在所有炎癥性疾病及癌癥的病理過程中發揮著重要作用[26]。研究表明，其可激活細胞內JAK2/STAT3信號傳導產生聯級反應，使炎癥呈瀑布樣爆發。IL-6與靶細胞表面的同源受體IL-6R識別并結合，進一步活化細胞膜表面糖蛋白130，進而激活JAK2，使受體酪氨酸激酶活化，并與STAT3蛋白結合，STAT3磷酸化形成二聚體，以此種形式轉運進入細胞核中以誘導受STAT3調控的基因表達，進一步產生IL-6因子，以及調控下游蛋白而加重炎癥反應[27-29]。HIF-1α是轉錄激活因子，對于腸道黏膜細胞的營養吸收、腸道屏障功能、先天性和適應性免疫反應至關重要[30]。于傳宗等[31]發現，野生蒙古口蘑多糖通過抑制JAK-STAT3和HIF-1α信號通路發揮抗炎作用，此進一步明確了HIF-1α參與了潰瘍性結腸炎的發生機制。

本研究結果顯示，消潰湯組的血清IL-6水平較模型組降低，IL-10水平升高，表明消潰湯能抑制IL-6分泌并促進IL-10的分泌，間接證明消潰湯能提高大鼠機體內單核細胞和巨噬細胞的功能，減少致炎因子的釋放。炎癥介質可分為促炎介質和抑炎介質兩類，兩者的平衡關系被打破就會導致嚴重的炎癥反應[32]。本研究證明消潰湯對促炎介質有抑制作用，對抑炎介質有一定的促進作用，調控相關因子可能是消潰湯發揮其治療作用的機制之一，但消潰湯是由多種藥物配伍而成，其作用機制有待進一步深入研究。

實驗結果表明，IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α與潰瘍性結腸炎具有相關性；消潰湯通過抑制IL-6、JAK2、STAT3基因的表達，從而減輕腸道炎癥反應，在治療UC中其機理可能通過抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路來完成。消潰湯能有效抑制致炎因子IL-6的釋放，降低JAK2/STAT3通路的過度磷酸化，引起下游基因HIF-1α轉錄翻譯水平的降低，削弱炎癥聯級反應。相關研究證實多種腫瘤的發生、進展、侵襲和轉移與JAK/STAT信號通路過度激活密切相關，病理狀態下HIF-1α過度激活會加劇腸道組織學和超微結構的改變，導致腸道損傷、炎癥和結腸直腸癌的發生[33-34]。本研究表明，消潰湯是通過一系列聯級反應對潰瘍創面進行治療使之恢復，并且對炎癥性腸病的癌變起到抑制作用。

綜上所述，消潰湯治療UC大鼠作用機制通過調節IL-6/JAK2/STAT3/HIF-1α軸，降低血清IL-6水平和抑制病變組織IL-6 mRNA表達，從而降低JAK2 mRNA表達，減少STAT3磷酸化，引起STAT3 mRNA表達量降低，并通過HIF-1α靶點抑制其基因表達，最終起到抗潰瘍性結腸炎作用，且能抑制其癌變。通過提取中藥有效成分針對IL-6/JAK2/STAT3/HIF-1α軸中相關蛋白和酶為靶點用于治療UC可能會成為未來研究的方向。然而JAK/STAT信號通路和其他信號通路之間的協同作用還沒有很好的解釋，尚需要進一步研究。