柴胡皂苷A通過LKB1-AMPK通路干預高脂血癥大鼠的作用機制研究*

杜昊炎，張 敏，李閃閃，張明昊，春 花，吳宗耀

(1.商丘市中醫院，河南 商丘 476000；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；3.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；4.西藏藏醫藥大學，西藏 拉薩 850000)

高脂血癥是一種體內脂肪代謝異常導致的疾病，其主要臨床特征是血液中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低[1]。根據流行病學調查，美國約33.5%的成年人血清總膽固醇水平升高(≥2.40 g/L)[2]，亞洲大多數國家因血脂水平升高并發的慢性病導致死亡率也在逐年上升，在中國血脂異常發生人數高達1.6億[3]。目前越來越多的研究證實，高脂血癥是動脈粥樣硬化[4]、腦血栓[5]、冠心病[6]、心肌梗死[7]等心腦血管疾病的重要危險因素，故調節血脂水平能有效降低多種慢性疾病的發生[8]。目前，世界上應用最廣泛的降血脂藥物是他汀類藥物，其不僅能有效調節肝臟中膽固醇合成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)中的限速酶來降低膽固醇水平，還能促進血脂代謝，但長期使用會造成肝腎功能、肌肉損害，并且還有誘發糖尿病的風險，停藥后還會出現血脂水平反跳等不良反應[9]，嚴重影響疾病的治療，導致心腦血管疾病等多種并發癥的發生，給生命健康帶來危害。中藥治療高脂血癥療效顯著，無明顯不良反應[10]。已經證實小柴胡湯[11]、大柴胡湯[12]等含柴胡的中藥復方有較好的降血脂作用，但中藥復方成分復雜、分子機制不清嚴重阻礙了疾病的治療。柴胡皂苷A是柴胡的主要有效成分,能通過調節脂代謝來調節血脂水平，而肝激酶B1(LKB1)/單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路已經被多項研究[13]證實與脂肪代謝密切相關。AMPK是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能維持細胞能量穩態，參與細胞能量代謝，調節脂質代謝。LKB1作為AMPK上游主要激酶，能磷酸化激活AMPK參與脂肪的能量代謝。因此，本研究對柴胡皂苷A的降血脂作用及機制展開研究，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

雄性SD大鼠60只，體質量180～200 g，鼠齡8周，由鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場提供，許可證號SCXK(豫)2019-0002，動物使用許可證號SYXK(豫)2020-0004。本研究經河南中醫藥大學動物倫理委員會批準，批準號DWLL20180018。

1.2 藥品、試劑與儀器

柴胡皂苷A，上海源葉生物科技有限公司產品，批號S25577；辛伐他汀片，華潤雙鶴利民藥業(濟南)有限公司，產品批號1810409，10 mg/片。氨基甲酸乙酯，天津百倫斯生物技術有限公司產品，批號20200326；TG測定試劑盒、T-C測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產品，批號分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司產品，批號分別為SP-9001、ZLI-9018；BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司產品，批號分別為G2026、G2003；兔抗大鼠AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、LKB1、HMGCR抗體，均為北京博奧森生物技術有限公司產品，批號分別為bs-10344R、bs-12972R、bs-3948R、bs-5068R。BS110S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司產品；MR-96TB酶標儀，騁克儀器(上海)有限公司產品；RM2235石蠟切片機，德國徠卡公司產品；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機，大龍興創實驗儀器(北京)有限公司產品；YD-6D型組織包埋機、YD-A型組織攤片機、YD-B型組織烤片機，均為金華市科迪儀器設備有限公司產品；CX23光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；CFX型熒光定量PCR儀，美國伯樂公司產品；Nano Drop 2000型超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將60只雄性SD大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、辛伐他汀組和柴胡皂苷低、中、高劑量組，每組10只。適應性喂養1周后，除正常組外，其他各組飼喂高脂飼料(白糖占10%、豬油占10%、蛋黃粉占10%、膽固醇占2%、基礎飼料占68%)，正常組大鼠常規飼養，連續喂養4周。造模同時，辛伐他汀組大鼠按9 μg/g給藥，柴胡皂苷低、中、高劑量組分別按5、10、20 μg/g給藥，灌胃體積均為10 μL/g；正常組和模型組給予等體積生理鹽水。各組均1次/d，連續4周。

1.4 檢測指標

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，以氨基甲酸乙酯1 g/kg體質量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，解剖取肝臟。

1.4.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C

4 ℃下，離心半徑10 cm，3 000 r/min轉速離心10 min，分離大鼠血清，按照試劑盒操作步驟檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.4.2 肝組織病理學形態

取大鼠同位置肝組織，以質量分數40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肝組織病理學形態。

1.4.3 肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平

采用免疫組織化學法檢測肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表達部位及表達情況。肝組織病理切片經脫蠟、水化后，H2O2封閉，PBS清洗，檸檬酸鹽緩沖液熱修復，山羊血清封閉，室溫孵育，分別滴加AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR抗體，4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，脫水，透明，封片，鏡檢，采用Image-Pro Plus 6.0測定每個視野中積分光密度(IOD)值，并進行統計分析。采用蛋白質印跡法(Western blotting)檢測肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表達水平。取肝組織，稱定質量，加入含有質量分數10 g/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，勻漿后，4 ℃，離心半徑10 cm，3 000 r/min離心15 min，上清液采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液和RIPA制備樣品，上樣量100 μg蛋白，經SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗[AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、LKB1(1∶1 000)、HMGCR(1∶1 000)兔抗單克隆抗體、β-actin兔抗單克隆抗體(1∶3 000)]過夜、洗滌；加入二抗[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(1∶10 000)]，室溫孵育1 h，ECL顯影并掃描。運用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，通過計算目的條帶與內參的灰度值比值來分析AMPK、p-AMPK、LKB1及HMGCR相對表達水平。

1.4.4 肝組織中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平

采用實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。根據GenBank數據庫(登錄號NM023991、NM001108069.1、NM013134.2、NM017008.4)的AMPK、LKB1、HMGCR基因序列設計特異性引物，引物序列見表1。制備肝臟勻漿，用TriQuick試劑充分研磨勻漿后提取總RNA，檢測RNA濃度及純度。在20 μL反應體系內合成cDNA，以2 μL cDNA為模板，加入靶基因上下游引物于15 μL反應體系內進行PCR擴增。

表1 Real-time PCR引物序列

反應結束后，根據擴增曲線及溶解曲線判斷PCR反應特異性。所得結果以GAPDH為內參，用2-△△CT法計算目的基因相對水平。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平對比

與正常組對比，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，4個給藥組TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷3個劑量組TG、TC水平升高(P<0.05)，低、中劑量組LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。與柴胡皂苷低劑量組對比，中、高劑量組TG、TC、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平對比

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學形態對比

正常組大鼠肝細胞形狀規則，呈索狀分布，細胞邊界清晰，未見脂肪滴；模型組大鼠肝細胞形態不規則，邊界模糊，細胞腫脹且大小不一致，胞漿內可見大量脂肪滴(箭頭所示)；辛伐他汀組和柴胡皂苷低、中、高劑量組大鼠肝細胞漿存在少量脂肪滴，肝組織病理學形態明顯改善。見圖1。

2.3 各組大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平對比

與正常組對比，模型組大鼠肝臟中有少量AMPK、p-AMPK、LKB1沉積，IOD值顯著減小(P<0.05)；有大量HMGCR沉積，IOD值顯著增加(P<0.05)。與模型組對比，4個給藥組大鼠肝臟中有大量AMPK、p-AMPK、LKB1沉積，IOD值顯著增加(P<0.05)；有少量HMGCR沉積，IOD值顯著減小(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷低、中劑量組大鼠肝臟中少量AMPK沉積、IOD值顯著減小(P<0.05)，而柴胡皂苷高劑量組有大量AMPK沉積，IOD值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷低、中、高劑量組有少量p-AMPK沉積、IOD值顯著減小(P<0.05)，有大量HMGCR沉積、IOD值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷低劑量組有少量LKB1沉積、IOD值顯著減小(P<0.05)，柴胡皂苷中、高劑量組有大量LKB1沉積、IOD值顯著增加(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的IOD值對比

Western blotting結果顯示：與正常組對比，模型組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1水平降低，灰度值減小，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，4個給藥組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1水平升高，灰度值增加(P<0.05)；HMGCR水平降低，灰度值減小(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷3個劑量組大鼠肝組織AMPK水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)；柴胡皂苷高劑量組大鼠肝組織LKB1水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)；柴胡皂苷低、中、高劑量組大鼠肝組織HMGCR水平顯著升高，灰度值顯著增加(P<0.05)。與柴胡皂苷低劑量組對比，柴胡皂苷中、高劑量組AMPK水平顯著升高，灰度值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷高劑量組大鼠肝組織LKB1水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)；柴胡皂苷中劑量組大鼠肝組織HMGCR水平顯著升高，灰度值顯著增加(P<0.05)；柴胡皂苷高劑量組大鼠肝組織HMGCR水平顯著降低，灰度值顯著減小(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的灰度值測定結果

2.4 各組大鼠肝臟組織中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平對比

與正常組對比，模型組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA水平降低，HMGCR mRNA水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，4個給藥組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA水平升高，HMGCR mRNA水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與辛伐他汀組對比，柴胡皂苷3個劑量組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA降低(P<0.05)，柴胡皂苷低、中劑量組大鼠肝組織HMGCR mRNA水平升高(P<0.05)。與柴胡皂苷低劑量組對比，柴胡皂苷中、高劑量組大鼠肝組織AMPK、LKB1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，HMGCR mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠肝臟組織中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平對比

3 討 論

高脂血癥是由于脂肪代謝或功能異常導致血液中脂質或脂蛋白水平異常升高的一種疾病，常因飲食失調、肥胖、家族性高膽固醇血癥等遺傳疾病或糖尿病等其他疾病引起[14]。高脂血癥以TC、TG、LDL-C升高和HDL-C降低為主要特征，其中TC是急性缺血性卒中患者卒中嚴重程度和預后不良的重要獨立預測因子。研究發現，中風患者的性別和血清TC、LDL-C和HDL-C水平之間存在顯著關聯，尤其是TC指標的變化與中風的嚴重程度密切相關[15-16]。目前研究還關注LDL-C與心血管疾病發生的關系，LDL-C包括乳糜微粒、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白及其殘余物等富含甘油三酯的脂蛋白。降低LDL-C可進一步減少心肌梗死、腦血管事件的發生，故本研究采用SD大鼠進行模型制備高脂血癥模型大鼠。結果發現，與模型對照組對比，柴胡皂苷A低、中、高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高。可見，柴胡皂苷A可較好地降低血脂指標。

高脂血癥的發生與脂代謝紊亂密切相關，而LKB1/AMPK信號通路已經被證實與脂代謝相關。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[17]，也是一種細胞能量傳感器，能參與機體的能量代謝調節過程，并在包括脂質代謝在內的多種代謝異常疾病中發揮著重要作用[18]。AMPK能通過上游LKB1在AMPKα亞基的Thr172處磷酸化而被激活[19]。在膽固醇的生物過程中，肝臟作為其主要器官，而HMGCR作為催化3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A轉化為甲羥戊酸的限速酶，其活性降低可以減少膽固醇的合成[20]。可見，激活AMPK蛋白可減少脂肪生成、增加脂肪酸氧化，以調節肝臟脂質代謝。鑒于此，本研究采用免疫組化和蛋白質印跡法，觀察柴胡皂苷A對LKB1/AMPK通路相關蛋白的表達變化。結果發現，與正常組對比，模型組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白水平顯著降低，說明高脂血癥大鼠與LKB1/AMPK信號通路相關；與模型組對比，柴胡皂苷A各劑量組大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、LKB1水平顯著升高，HMGCR水平顯著降低；柴胡皂苷A各劑量組對比，柴胡皂苷A高劑量組大鼠肝組織LKB1水平升高最明顯，HMGCR水平降低最顯著。最后，為了驗證結果的一致性，還對AMPK、LKB1、HMGCR mRNA進行檢測，結果發現mRNA與蛋白的表達趨勢一致，進一步驗證柴胡皂苷A能通過LKB1/AMPK通路降低高脂血癥大鼠的血脂的分子機制。

此外，本研究還在形態學上觀察柴胡皂苷A的治療效果，采用HE染色的方法觀察各組高脂血癥大鼠肝臟的病理變化，結果發現，正常組大鼠肝細胞形狀規則，呈索狀分布，細胞邊界清晰，未見脂肪滴；而模型組大鼠肝細胞形態不規則，邊界模糊，細胞腫脹且大小不一致，胞漿內可見大量脂肪滴；柴胡皂苷A各劑量組大鼠肝細胞漿雖存在少量脂肪滴，但有顯著改善。

綜上所述，柴胡皂苷A能改善高脂血癥大鼠的血脂水平，其作用機制是通過降低HMGCR蛋白和促進LKB1/AMPK信號通路表達，而達到降血脂的作用。