外泌體lncRNA在肝細胞癌中的作用*

郭 鑫，杜 華 綜述，師迎旭，3△ 審校

1.內蒙古醫科大學第一臨床醫學院，內蒙古呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古呼和浩特 010050;3.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古呼和浩特 010050

肝細胞癌(HCC)是最常見的原發性肝癌，在中國，HCC發病率、病死率分別位于惡性腫瘤的第6位和第3位[1]。HCC發生的具體病因尚未明確，其主要危險因素包括乙型/丙型肝炎病毒感染、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎等[2]。惡性腫瘤嚴重影響人類的健康，由于惡性腫瘤的發病機制復雜、進展迅速且不易早期診斷，因此，當前惡性腫瘤的早期診斷、精準診療成為研究熱點。腫瘤的發生、發展依賴于腫瘤細胞和腫瘤微環境之間的相互作用，除了細胞間接觸和釋放可溶性因子的途徑外，腫瘤細胞還可以通過外泌體與腫瘤微環境進行交流。研究發現，腫瘤源性外泌體攜帶的內容物DNA、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)等分子反映了起源于腫瘤細胞的基因或信號變化[3]。lncRNA在各種惡性腫瘤中被解除調控，且與惡性腫瘤的進展密切相關。已有研究證實，lncRNA是HCC的原癌基因/抑癌基因[4]。HCC來源的外泌體lncRNA被發現在HCC增殖、轉移、血管生成、診斷、治療、預后中都發揮重要作用。外泌體lncRNA成為近年來的研究熱點，有廣泛的應用前景。本文綜述了HCC分泌的外泌體lncRNA對腫瘤微環境及HCC細胞生物學特性的調節作用，以期為臨床研究HCC的發病機制、診治方法提供參考。

1 外泌體概述

外泌體是一種可以被大多數細胞分泌的微小膜泡，具備脂質雙分子層結構，直徑30～150 nm，屬于細胞外囊泡(EVs)的亞群。外泌體經胞外刺激、微生物攻擊或其他應激條件誘導產生[5]。目前普遍認為，外泌體的產生始于細胞膜內陷形成早期內體，隨后早期內體膜向內出芽形成多囊泡體(MVB)，即晚期內體。最終，在內體轉運分選復合物(ESCRT)及特定蛋白質的調控下，MVB分泌到胞外形成外泌體(圖1)。由細胞釋放到胞外的外泌體存在于多種體液中，如血漿、血清、尿液和鼻分泌物等[6]。外泌體內包含蛋白質、DNA、信使RNA(mRNA)、miRNA、lncRNA等分子，可作為信號分子傳遞給受體細胞，參與細胞間通訊和微環境的調節[7]。因此，調控lncRNA的表達可能成為治療腫瘤的一種新策略。同時，由于外泌體存在于相對獨立的環境中，比組織或體液中自由存在的腫瘤生物標志物具有更高的穩定性，這一特點使外泌體有成為腫瘤生物標志物的潛能。

圖1 外泌體形成和被靶細胞攝取

2 外泌體lncRNA在HCC中的作用

lncRNA是一類長度不小于200 nt的非編碼RNA，腫瘤來源的外泌體lncRNA可作為腫瘤細胞間協調細胞功能的信號媒介。lncRNA在維持細胞生命活動中發揮重要作用。lncRNA不可編碼蛋白質，但其在表觀遺傳、轉錄前、轉錄中、轉錄后的基因表達調控中發揮重要作用[8]。lncRNA主要通過以下3種方式來發揮調控作用：(1)lncRNA作為競爭性內源RNA(ceRNA)調節miRNA表達；(2)lncRNA與蛋白質相互作用；(3)lncRNA直接與細胞核DNA結合發揮作用。雖然關于lncRNA的研究較多，但目前對lncRNA的種類、數量和功能仍了解較少。lncRNA的失調在調控原癌基因和抑癌基因中起主要作用[9]。近年來，HCC細胞分泌的外泌體lncRNA異常表達也逐漸被發現，且其對HCC的發生、發展有極大影響[10-18],見表1。

表1 不同外泌體lncRNA對HCC發生、發展的影響

2.1外泌體lncRNA對HCC細胞增殖、轉移的影響 HCC細胞因具有高增殖、轉移能力而導致腫瘤相關死亡。盡管如此，由于缺乏對HCC細胞增殖、轉移的完全了解，影響了HCC的治療研究進展。lncRNA對腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力均有調節作用[19]。HUANG等[10]研究發現，HCC源性外泌體中lnc85特異性升高，對HCC細胞的增殖、遷移過程有重要調控作用，lnc85可靶向結合miR-324-5p(一種腫瘤抑制因子)，導致miR-324-5p失調而促進HCC細胞增殖、轉移。WANG等[12]發現，lncRNA SENP3-EIF4A1可通過外泌體從正常細胞傳遞至HCC細胞，降低HCC細胞的增殖和遷移能力，從而抑制HCC的體內外進展。CAO等[11]研究發現，lncRNA HULC在HCC組織、HCC患者血清中高表達，且lncRNA HULC在HCC源性外泌體中的表達與腫瘤TNM分期相關。lncRNA HULC作為海綿分子負向調控miR-372-3p介導的對Rab 11a的抑制作用，從而促進HCC發生、發展，這一發現為lncRNA HULC在HCC中的作用機制研究提供了新的依據。外泌體lncRNA SENP3-EIF4A1通過競爭性結合miR-9-5p，促進ZFP36表達，抑制HCC細胞的增殖、轉移[12]。

此外，腫瘤的增殖、轉移同時受腫瘤細胞和腫瘤微環境的雙重調節[20]。研究證明，腫瘤細胞在腫瘤發生、發展過程中會釋放外泌體[21]。腫瘤源性外泌體可以通過分泌活性分子(mRNA、miRNAs、lncRNA、蛋白質等)調節腫瘤微環境，進而影響腫瘤的發生、發展。外泌體的分泌是一個多分子調控的復雜過程，涉及MVB的運輸、與質膜對接和融合[22]。lncRNA在HCC分泌外泌體的過程中起關鍵作用，YANG等[13]發現，lncRNA HOTAIR可以誘導MVB向質膜轉運，通過調控RAB35的表達和定位來控制MVB與質膜的對接過程。此外，lncRNA HOTAIR還可以影響VAMP3和SNAP23的共定位和活性，促進MVB與質膜融合，達到促進HCC分泌外泌體的目的，這個發現證實了lncRNA具有促進腫瘤分泌外泌體的新功能，也為腫瘤lncRNA的研究提供了新思路。

2.2外泌體lncRNA對HCC免疫系統的影響 肝臟被稱為“免疫特惠器官”，其內含有較多的白細胞,包括肝巨噬細胞、自然殺傷細胞等，所以肝細胞更易被誘導為免疫耐受狀態(耐受原性)。lncRNA在天然免疫或獲得性免疫中均發揮著重要作用，包括對免疫系統的激活和穩態的調節。正常情況下，機體的免疫系統可以識別并清除腫瘤細胞，但HCC源性外泌體lncRNA可介導機體產生免疫耐受。巨噬細胞是機體天然免疫中的關鍵角色，是腫瘤微環境的參與者。在受到腫瘤微環境刺激后，巨噬細胞可極化為M1促炎型和M2抗炎型兩種表型，這兩種表型可在不同的腫瘤微環境下動態地進行相互轉換[23]。LI等[14]研究發現，HCC來源的外泌體中富含lncRNA TUC339，可介導HCC細胞與周圍環境中巨噬細胞的信號傳導。HCC源性外泌體lncRNA TUC339被腫瘤微環境中的巨噬細胞攝取后，可促進巨噬細胞向M2抗炎型轉化，從而抑制促炎細胞因子[如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-12]產生，介導HCC細胞免疫逃避(抑制機體的免疫反應)，此發現為腫瘤和免疫細胞之間的相互作用研究提供了新的思路，揭示了HCC治療的新靶點。FAN等[15]研究表明，HCC細胞外泌體lncRNA PCED1B-AS1被受體HCC細胞攝取后，可以靶向miR-194-5p，促進PD-Ls的表達，繼而抑制T淋巴細胞和巨噬細胞功能，誘導HCC免疫抑制。因此，lncRNA PCED1B-AS1是一種潛在的HCC治療靶點。

2.3外泌體lncRNA對HCC血管生成的影響 腫瘤血管生成是指腫瘤組織形成新血管的過程。血管生成有利于腫瘤細胞獲得充足的氧氣和營養物質，是促進腫瘤發生、發展的關鍵。血管生成是一個極其復雜的過程，受腫瘤細胞或腫瘤微環境的誘導等因素調節，涉及腫瘤細胞、內皮細胞、腫瘤微環境之間的相互作用。由于腫瘤組織中未成熟的血管受到周圍腫瘤細胞的壓迫，導致生成的血管畸形、曲折。腫瘤血管往往表現為血流混亂，且血管內皮細胞之間連接松散，有高度的滲漏性和通透性，這一特性有助于腫瘤細胞進入血管，隨血液遠處轉移。目前，抗HCC血管生成已經成為一種治療策略，較多學者開始深入研究HCC的血管生成過程。lncRNA對腫瘤血管生成有促進和抑制的雙重作用，外泌體lncRNA參與腫瘤細胞間、細胞間質間的物質運輸和信號傳導。HCC分泌的外泌體lncRNA參與HCC血管生成。LI等[16]研究發現，lncRNA SNHG16/miR-4500/GALNT1軸在體外、體內外泌體介導的腫瘤血管生成中發揮重要作用。

目前，關于HCC源性外泌體miRNA促進和抑制腫瘤血管生成的研究很多，但外泌體lncRNA對HCC血管生成的影響研究極少，其參與HCC發生、發展的具體機制也不明確，仍需大量研究來進一步驗證。

2.4外泌體lncRNA對HCC治療藥物療效的影響 HCC的治療手段包括手術治療、放療、化療、中醫治療等，這些方法可以有效控制原發灶，抑制腫瘤生長。化療藥物治療是一種重要的HCC治療手段。目前，有很多針對HCC的化療藥物，但耐藥性是影響療效的重要因素。索拉非尼和阿霉素是常規的HCC全身或局部化療藥物，HCC對其有很強的耐藥性[24]。為了更好地治療HCC，研究HCC先天或獲得性耐藥的具體機制是非常必要的。腫瘤耐藥細胞分泌的外泌體可以通過傳遞lncRNA向敏感細胞傳遞耐藥性[25]。TAKAHASHI等[17]研究發現，TGF-β可以降低HCC細胞對索拉非尼/阿霉素的敏感性，同時促進lncRNA-ROR在HCC細胞及其外泌體中富集。受體細胞攝取了富集lncRNA-ROR的外泌體后，減少了化療誘導的細胞死亡。WANG等[18]發現，外泌體lncRNA H19通過海綿作用于miR-520a-3p，上調LIM激酶1，促進異丙酚治療后的HCC細胞增殖、遷移和侵襲，抑制HCC細胞凋亡。這一結果提示，通過干預受體細胞與lncRNA的作用，可以改善HCC對化療藥物的耐藥性，或許這將會是一種新的HCC治療方法。

3 外泌體lncRNA用于HCC診斷

早期HCC可以采取手術治療(如肝切除、肝移植)，然而，大多數的HCC患者都是在不可手術的晚期才被確診[26]。因此，雖然HCC的診斷和治療技術已經較為成熟，但早期診斷方法仍存在不足，從而導致患者預后不良。對于HCC的早期診斷或動態監測，需要一種新型、高靈敏度、高特異度，且可區分HCC與非HCC的微創指標。血清甲胎蛋白(AFP)是實驗室診斷HCC的常用標志物，但其存在特異度較低、誤診率較高的缺點[27]。穿刺活檢是診斷HCC的“金標準”，但其屬于有創檢查，容易造成腫瘤細胞經穿刺孔擴散。最近的研究表明，HCC微環境中不同細胞群體間的外泌體內容物(mRNA、miRNA、lncRNA等)交換不僅在HCC的發生和維持中起著關鍵作用，而且可能是HCC敏感的非侵入性生物標志物和治療靶點。外泌體lncRNA可以在體液中保持穩定狀態，并存在代表不同腫瘤細胞特性的表達譜，研究這些lncRNA可能有利于HCC早期診斷。

LU等[28]研究發現，HCC外泌體分泌的lncRNA(lncRNA ENSG00000248932.1、ENST00000440688.1、ENST00000457302.2)比AFP具有更高的診斷靈敏度和特異度，這3項lncRNA指標可能是預測慢性肝炎患者或健康人HCC發生風險的潛在生物標志物，也可用于HCC轉移的動態監測。XU等[29]證明，聯合檢測血清外泌體lncRNA ENSG00000258332.1、LINC00635和AFP診斷HCC的曲線下面積為0.894，提示上述指標聯合檢測可能是一種可行的HCC診斷方法。除此之外，lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635高表達與HCC淋巴結轉移、TNM分期有關，且可預測HCC患者的存活期，而且在患者接受手術治療后上述兩種lncRNA水平均顯著降低，提示lncRNA有助于HCC患者的臨床分期和預后評估。經過多因素分析，LEE等[30]發現，外泌體lncRNA-ATB是HCC進展的獨立預測因子，外泌體lncRNA-ATB水平高的患者存活率明顯降低，提示lncRNA-ATB可以作為HCC患者的預后標志物。HUANG等[10]發現，血清外泌體lnc85在AFP陽性和AFP陰性的HCC患者中均有較高的表達水平，并且可以很好地區分AFP陰性的HCC患者、健康人及肝硬化患者，此發現提示lnc85有作為HCC生物標志物的潛力。

4 總結與展望

綜上所述，外泌體與HCC關系密切，作為與周圍基質交流的橋梁，外泌體可以調節腫瘤微環境和細胞間的通訊。HCC外泌體lncRNA在HCC的發生、發展、侵襲、轉移中發揮著重要作用，也可用于HCC的早期診斷、治療及預后評估。但仍存在一些認知及技術方面的不足：(1)外泌體的分離、純化技術不成熟，無法保證外泌體的純度、活性；(2)外泌體由多種細胞分泌，如何確定其來源還有待研究；(3)外泌體作為靶向治療藥物載體的體外合成技術還有待提高；(4)外泌體lncRNA在多種腫瘤中發揮作用，但具體機制不明確；(5)外泌體lncRNA作為HCC診斷分子標志物的特異性還無法確定；(6)多個外泌體lncRNA對HCC有相同的作用靶點，完全解析其調控網絡仍較困難。相信隨著對外泌體lncRNA的深入研究，上述問題均可被逐一解決。研究HCC外泌體lncRNA的作用對HCC甚至其他腫瘤的診療均具有重要意義。