CIK細胞對裸鼠人肝癌移植瘤生長的抑制作用

吳 念,馮虎翼,劉 樺,曹 陽,余福財,陳元文

重慶市第五人民醫院肝膽胰甲乳外科，重慶 400062

肝癌不僅惡性程度高，還具有起病隱匿的特點，大部分患者就診時已經是中晚期，因此其也是目前臨床治療較為困難的疾病之一。 雖然肝部分切除、肝移植、介入栓塞全身化療是目前治療肝癌的主要方法，但治療后肝癌復發轉移仍十分常見，且中晚期肝癌患者免疫力低下，臨床治療效果差。尋找新的治療方法對改善終末期肝癌患者的生活質量，提高其生存率有重要意義。近年來，生物免疫治療已成為一種新的治療腫瘤的方法，并逐漸受到研究者的重視，其有較高的抑瘤率，被認為是最有前景的中晚期肝癌治療方法之一[1-3]。細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)是通過γ干擾素 (IFN-γ)、抗CD3單克隆抗體和白細胞介素(IL)-2與外周血單個核細胞在體外擴增和激活的T淋巴細胞，是一群異質的免疫活性細胞，同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，兼有自然殺傷細胞(NK細胞)非主要組織相容性復合體(MHC)限制殺瘤特點和T淋巴細胞的強大抗瘤活性,不僅可通過非特異性免疫殺傷作用消除腫瘤患者體內的微小殘留病灶，還可以調節和增強機體的免疫功能[4-8]。本研究通過觀察CIK細胞靜脈注射對裸鼠人肝癌移植瘤生長的抑制作用，旨在為肝癌的生物免疫治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1標本來源 BALB/c裸鼠，雄性，4～5周齡,16～18 g,32只，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所(京)[2009-0004]。SMMC-7721人肝癌細胞由重慶醫科大學感染分子病學重點實驗室惠贈。

1.2儀器與試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國HyClone公司，DeadEndTM比色法凋亡檢測系統購自美國Peomage公司,檢測T淋巴細胞亞群的相關抗體購自美國BD公司，抗CD3單克隆抗體購自北京軍事醫學科學院，Ki-67購自北京中杉金橋生物技術有限公司，重組人白細胞介素2(rhIL-2)、重組人γ干擾素(rhINF-γ)購自北京雙鶴藥業有限公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，BriCyte E6流式細胞儀購自深圳邁瑞公司。

1.3細胞培養

1.3.1SMMC-7721人肝癌細胞培養 SMMC-7721人肝癌細胞常規培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、含5%CO2的飽和水蒸氣培養箱中培養，隔天對指數增生期的細胞進行傳代。取對數生長期的培養細胞，用0.25%的胰酶消化、離心、生理鹽水重懸后，對細胞懸液進行計數及臺酚藍染色，當細胞活力達95%以上時，調整細胞濃度后接種于裸鼠皮下。

1.3.2CIK細胞制備 采集健康志愿者外周血30 mL，經人淋巴細胞分離液密度梯度離心后獲得外周血單個核細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，調整細胞濃度至1×106個/毫升，加入rhINF-γ(1 000 U/mL)，24 h后加入抗CD3單克隆抗體(50 ng/mL)、rhIL-2(500 U/mL),以后每3天補加新鮮培養基，并補加rhIL-2(500 U/mL)，第14天行流式細胞術(FCM)檢測CIK細胞表型，CD3+CD56+CIK細胞達20%以上為合格。

1.4動物模型建立及分組實驗 將對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞(2×106個/毫升)以每只0.2 mL，種植于32只BALB/c裸鼠右側背部皮下，約第4天成瘤，成瘤率約95%,第10天移植瘤最大徑達0.4～0.5 cm,將其中30只合格的模型裸鼠隨機分為CIK細胞組(A組)、空白對照組(B組)，每組15只。A組給予尾靜脈注入3×107個檢測合格的CIK細胞，每周1次，共4次；B組不予處理。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1腫瘤生長情況 在治療前及治療開始后每4天測量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b),計算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2,觀察腫瘤的生長情況。治療至第32天時，計算CIK細胞抑瘤率，抑瘤率=(B組腫瘤平均體積-A組腫瘤平均體積)/B組腫瘤平均體積×100%。

1.5.2病理組織學檢查 在治療第32天處死所有裸鼠，取腫瘤組織，立即用4%的多聚甲醛浸沒，常規制備石蠟包埋切片，進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學顯微鏡下觀察腫瘤組織病理改變。

1.5.3免疫組織化學法檢測腫瘤組織Ki-67蛋白表達 瘤塊固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、過氧化氫封閉，微波修復抗原。腫瘤組織切片滴加Ki-67一抗，濕盒中過夜，加二抗，二甲基聯苯胺(DAB)染色。用已知陽性標本作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。陽性表現為細胞核為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景為紫藍色。用專業圖像分析軟件(Image-Pro Plus6.0)分析陽性程度。

1.5.4脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法檢測腫瘤細胞凋亡 采用TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況，石蠟包埋、切片、脫蠟、過氧化氫封閉,按TUNEL試劑盒說明書分別加入b-11-DUTP、TDT、Streptavidin-HRP，DAB顯色，蘇木精復染，以PBS代替TUNEL反應液為陰性對照。陽性表現為細胞核為棕黃色或棕褐色，背景為紫藍色。用專業圖像分析軟件(Image-Pro Plus6.0)分析陽性程度。

2 結 果

2.1CIK細胞表型鑒定 體外將外周血單個核細胞培養14 d后，細胞總量擴增約20倍，CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+效應細胞亞群的比例明顯增高，分別由最初的58.0%、6.7%、24.6%上升至93.5%、41.7%、43.0%。經FCM檢測，CIK細胞中CD3+CD56+CIK細胞比例達41.7%，合格，見圖1。

圖1 CIK細胞FCM檢測圖

2.2病理組織學檢查結果 光鏡下A、B組均可見不同程度的腫瘤細胞結構和數量改變。A組腫瘤細胞排列松散，腫瘤細胞內部發生核固縮，細胞質減少，嗜酸性增強；B組腫瘤細胞生長活躍，排列緊密，核大深染，有較多核分裂象，呈增殖樣改變，見圖2。

注：A為A組；B為B組。

2.3CIK細胞抑制裸鼠人肝癌移植瘤生長 治療前，A、B組腫瘤體積比較，差異無統計學意義(P>0.05)。從治療第4天開始，A組腫瘤體積增長慢于B組，12 d以內兩組腫瘤體積增長趨于緩慢，12 d以后，兩組腫瘤體積增長明顯加快，但A組腫瘤體積增長明顯慢于B組，至第32天時，A組腫瘤體積明顯小于B組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3和表1。治療至第32天時，CIK細胞抑瘤率為43.06%。

圖3 兩組腫瘤生長曲線

表1 兩組治療前后腫瘤體積比較

2.4免疫組織化學法檢測腫瘤組織Ki-67蛋白表達結果 A組Ki-67蛋白陽性細胞相對較少，染色較淺，大多為棕黃色，B組Ki-67蛋白陽性細胞多，染色較深，大多為棕褐色，見圖4。A組腫瘤組織Ki-67蛋白表達的吸光度值為0.68±0.11，低于B組的0.80±0.11，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為A組；B為B組。

2.5TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡結果 A組凋亡細胞明顯增多，染色深，呈棕黃色，B組凋亡細胞數量較少，染色呈棕褐色，見圖5。A組凋亡細胞的吸光度值為0.52±0.05，明顯高于B組的0.40±0.05，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

生物免疫治療是利用機體的免疫機制，通過主動或被動的方式增強機體的免疫功能，從而達到殺傷腫瘤的目的。CIK細胞是一類新型的免疫活性細胞，具有強大的抗瘤活性和限制性非特異性殺瘤特點。以CIK細胞為代表的生物免疫治療正逐漸成為中晚期腫瘤治療的重要手段之一[7-8]。為明確CIK細胞免疫治療對肝癌的抑制作用，本研究進行了相關探討。

首先，建立裸鼠人肝癌移植瘤模型是本研究的基礎。用BALB/c裸鼠建立動物模型，背部皮下接種SMMC-7721人肝癌細胞，便于觀察移植瘤生長且成瘤率較高，方便實驗操作，同時SMMC-7721人肝癌細胞具有人源性，符合實驗要求。本研究采用FRANCESSCHTTI等[9]推薦的方法，從健康人外周血中提取單個核細胞，成功誘導高比例CD3+CD56+表型的CIK細胞。通過尾靜脈注射的方法將具有免疫活性的CIK細胞注入裸鼠體內，可較好的模擬機體內環境。從CIK細胞治療的第4天開始，A組腫瘤體積增長較B組慢，治療12 d后，B組腫瘤體積增長明顯加快，且明顯快于A組。治療至32 d時，CIK細胞的抑瘤率高于40%，提示CIK細胞治療對裸鼠移植瘤有效，療效較KIM等[10]的研究結果稍差，其研究的抑瘤率達60%，這可能與動物模型的個體差異或誘導試劑的質量差異有關。類似結果在CIK細胞抑制其他腫瘤生長的研究中也有報道[11-12]。

CIK細胞保留了少數效應記憶T淋巴細胞亞群的特征，具有抗腫瘤細胞毒性。CIK細胞同時表達幾種NK細胞表面標記物。由于存在功能性T淋巴細胞受體(TCR)和NK細胞分子，CIK細胞具有雙重性質，其抗腫瘤活性可追溯到NK樣結構[DNAX-輔助分子-1(DNAM-1)、NK細胞活化受體2D(NKG2D)、NK細胞p30相關蛋白(NKp30)和CD56]，具體作用機制主要為以下幾方面：一方面，體外高度擴增的CIK細胞中CD3+CD56+免疫活性細胞所占比例高，其通過釋放顆粒酶、穿孔素等細胞毒性物質可以溶解腫瘤細胞，起到直接殺瘤作用。CIK細胞兼有細胞毒活性的T淋巴細胞抗原α/β受體(TCR-α/β)，TCR-α/β在細胞外可有效刺激易感的腫瘤靶細胞，并與其相結合，釋放有溶瘤作用的胞質顆粒。另一方面，CIK細胞表面可大量表達NKG2D，NKG2D可與多種腫瘤細胞表達的應急誘導蛋白[可溶性MHC-I類分子相關蛋白(MIC)-A/B]和總UL16結合蛋白(ULPB)等相互識別，通過與非限制性MHC配體(NKG2D配體)結合，發揮抗腫瘤作用[6,13]。最后，活化的CIK細胞亦可產生大量細胞因子(INF-γ、IL-6、腫瘤壞死因子α、粒細胞巨噬細胞刺激因子、IL-2)，這些活化的細胞因子具有調節機體免疫系統功能或抑制腫瘤生長的作用[14]。

Ki-67是一種增殖細胞相關抗原，其功能與有絲分裂密切相關，在細胞周期G1、S、G2和M期出現，半衰期較短，可準確反映腫瘤細胞的增殖活性。本研究檢測了兩組腫瘤組織Ki-67蛋白的表達情況，結果發現，A組Ki-67蛋白表達的吸光度值顯著低于B組(P<0.05)，提示A組移植瘤中處于增殖狀態的腫瘤細胞少，表明CIK細胞可顯著抑制腫瘤細胞增殖。對移植瘤組織的原位凋亡檢測發現，A組凋亡細胞吸光度值明顯高于B組(P<0.05)，提示CIK細胞可誘導腫瘤細胞凋亡。CIK細胞不但可以表達Fas,也可以表達Fas配體(FasL),其FasL與腫瘤細胞的Fas相結合，誘導腫瘤細胞凋亡；活化的CIK細胞還能促使腫瘤細胞凋亡基因(如Survivin、DAD1、Bcl-xL、Bcl-2基因)的表達上調，誘導腫瘤細胞的凋亡或壞死[13-15]。

綜上所述，本研究在體外動物模型中證實了CIK細胞既可抑制腫瘤細胞增殖，又可誘導腫瘤細胞凋亡。CIK細胞免疫治療將能以“優勢互補”的方式參與到肝癌綜合治療中，有望成為中晚期肝癌治療的有效方法之一。