孝感地區(qū)傳染性單核細胞增多癥患兒EBV抗體、DNA檢測結(jié)果及社區(qū)居民流行病學分析*

陽仕雄,明 亮,劉瑞菡△

武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院/孝感市中心醫(yī)院：1.中心實驗室；2.檢驗科,湖北孝感 432000

傳染性單核細胞增多癥(IM)是兒童較常見的以單核-巨噬細胞系統(tǒng)急性增生為特點的傳染病，臨床表現(xiàn)特異性不強，主要有發(fā)熱、咽峽及扁桃體炎、頸部淋巴結(jié)腫大、肝脾大等[1]。IM多由EB病毒(EBV)感染所致，人類對EBV普遍易感，流行病學調(diào)查顯示，多數(shù)人初次感染EBV是在兒童時期[2-3]。EBV是皰疹病毒科雙鏈DNA病毒，主要通過唾液飛沫傳播，也可通過血液傳播[4]。EBV感染觸發(fā)細胞免疫反應，但其往往不能被完全清除，機體免疫力低下時可出現(xiàn)復發(fā)感染[5]。IM臨床表現(xiàn)多樣且不典型，早期診斷相對困難，容易漏診、誤診。因此，及時有效的實驗室檢測對臨床診斷尤為重要。現(xiàn)階段EBV的檢測主要是檢測EBV抗體及DNA[6]。由于EBV抗體的種類較多，不同抗體在IM患者中的陽性率不同。對于EBV DNA，可用于檢測的標本包括外周血總DNA、血漿及外周血單個核細胞(PBMC)，不同標本的檢測結(jié)果也存在一定差異[7]。

目前，國內(nèi)少有關(guān)于不同標本EBV DNA檢測結(jié)果差異的相關(guān)報道。本研究主要對湖北省孝感地區(qū)IM患兒EBV抗體及DNA的檢測結(jié)果進行分析，并探討血漿及PBMC中EBV DNA檢測結(jié)果的差異，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2016年12月至2020年12月在本院住院的IM患兒120例為病例組，中位年齡4歲；男73例，女47例。納入的患兒均存在IM的臨床癥狀；EBV DNA陽性或EBV衣殼抗原(VCA)IgM陽性。選取同期于本院體檢的兒童124例為對照組，中位年齡5歲；男70例，女54例；均為臨床診斷排除IM的兒童。從本院體檢者中選取具備EBV抗體及DNA檢測結(jié)果的1 522例孝感地區(qū)社區(qū)居民作為研究對象，入選標準：不存在EBV感染的臨床癥狀；EBV DNA及VCA IgM均為陰性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2儀器與試劑 主要試劑：EBV系列酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(北京貝爾生物工程股份有限公司)、 EBV核酸擴增熒光定量檢測試劑(中山大學達安基因股份有限公司)。主要儀器：科華ST-360型酶標儀、ABI 7500實時熒光定量PCR儀。

1.3方法

1.3.1EBV抗體檢測 采集所有研究對象靜脈血2 mL，4 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心8 min(離心半徑16 cm)，取上清液，用ELISA檢測EBV抗體。

1.3.2EBV DNA檢測 檢測血漿標本時，采集靜脈血2 mL，4 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心8 min，取血漿，加入DNA提取液并于100 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min,取上清液，用實時熒光定量PCR檢測EBV DNA水平。檢測PBMC標本時，取2 mL全血加2 mL生理鹽水稀釋，加淋巴細胞分離液后2 000 r/min離心20 min。取中層細胞層，12 000 r/min離心5 min,取上清液，再加入DNA提取液并于100 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用實時熒光定量PCR檢測EBV DNA水平。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組EBV抗體及DNA檢測結(jié)果比較 病例組EBV DNA、VCA IgA、VCA IgM、核抗原(NA) IgA、早期抗原(EA) IgA陽性率均高于對照組，VCA IgG、NA IgG陽性率均低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組EBV抗體及DNA檢測結(jié)果比較[%(n/n)]

2.2不同年齡段社區(qū)居民EBV抗體陽性率分布 體檢時開展EBV抗體檢測的社區(qū)居民1 522例主要分布在較低年齡段，其中未成年人(<18歲)1 208例，占79.37%。根據(jù)人群年齡分布特點，本研究對社區(qū)居民進行了年齡分層，分為未成年人(<18歲，并根據(jù)人數(shù)分布進行年齡段細分)、青年(18～<45)、中年(45～<60歲)、老年(≥60歲)。各年齡段VCA IgA、NA IgA、EA IgA陽性率均較低，NA IgG和VCA IgG在≥1歲居民中陽性率隨著年齡增長有逐漸增高趨勢，在≥60歲居民中NA IgG、VCA IgG陽性率均達100%。見表2。

表2 不同年齡段社區(qū)居民EBV抗體陽性率分布[%(n/n)]

2.3不同標本EBV DNA的檢測結(jié)果 120例IM患兒中，86例患兒采集PBMC標本進行了EBV DNA檢測，陽性率為94.19%(81/86)，104例患兒采集血漿標本進行了EBV DNA檢測，陽性率為82.69%(86/104)。有72例患兒同時采集PBMC及血漿標本進行了EBV DNA檢測，其中PBMC標本檢出EBV DNA陽性69例，陽性率為95.83%(69/72),血漿標本檢出EBV DNA陽性59例，陽性率為81.94%(59/72)，PBMC標本EBV DNA陽性率高于血漿標本，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前實驗室檢測EBV DNA、EBV抗體及外周血異形淋巴細胞等是診斷IM的主要依據(jù)[8]。EBV原發(fā)感染時，VCA IgM最先出現(xiàn)并持續(xù)存在約1個月，EA IgG出現(xiàn)較晚；VCA IgG更晚出現(xiàn)且長期存在，并在再發(fā)感染時其水平再次升高；NA IgG出現(xiàn)最晚且同樣長期存在[9]。本研究病例組VCA IgM陽性率為80.83%，表明VCA IgM在IM患兒中有較高的陽性率，可以作為診斷IM的重要輔助指標之一。病例組VCA IgA、NA IgA、EA IgA陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示在IM患兒中上述抗體有較高的陽性率，可與VCA IgM聯(lián)合用于IM的診斷。

VCA IgG與NA IgG陽性提示既往感染EBV，該陽性結(jié)果可長期存在[9]。相關(guān)報道顯示，IM患兒VCA IgG陽性率高于健康對照者[10]，但本研究顯示，病例組VCA IgG與NA IgG陽性率明顯低于對照組(P<0.05)，與上述研究結(jié)果存在差異，考慮這可能與本地區(qū)IM患兒EBV感染的流行病學特點有關(guān)，本研究納入的多數(shù)IM患兒既往未感染過EBV，因此對EBV易感，而對照組中既往感染者較多，可能對再發(fā)感染形成了一定免疫力。本研究結(jié)果顯示，孝感地區(qū)社區(qū)居民中VCA IgG與NA IgG陽性率較高，且在≥1歲居民中隨著年齡增長，其陽性率有增高趨勢，表明在社區(qū)居民中既往感染EBV極為常見，且年齡越大的人群既往感染率越高。研究顯示，社區(qū)兒童EBV感染較為常見，且大部分既往感染無明顯癥狀[11]。VCA IgG與NA IgG陽性率在<1歲兒童中較高，而在1～<2歲兒童中驟然降低。嬰兒期VCA IgG與NA IgG陽性率較高可能與機體免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，產(chǎn)生的抗體無法持續(xù)存在有關(guān)[12]；此外，<1歲兒童可能存在異嗜性抗體，造成較多的假陽性結(jié)果[13]。因此對<1歲兒童進行EBV抗體檢測時，必須注意排除假陽性的情況。

不同標本的EBV DNA檢測結(jié)果存在差異。本研究中，86例IM患兒的PBMC標本EBV DNA陽性率達94.19%，而104例IM患兒血漿標本EBV DNA陽性率僅為82.69%；此外，有72例患兒同時采集PBMC及血漿標本進行了EBV DNA檢測，PBMC標本EBV DNA陽性率也高于血漿標本(P<0.05)。既往研究報道，EBV感染后的恢復期，血漿中的EBV DNA可較快轉(zhuǎn)陰，而PBMC 中的EBV DNA陽性則持續(xù)較長時間[14]。隊列研究發(fā)現(xiàn)，EBV感染時，血漿EBV DNA檢測診斷EBV感染的特異度高于檢測PBMC中的EBV DNA[15]。在本研究中，血漿EBV DNA較低的陽性率可能提示部分患者EBV DNA已轉(zhuǎn)陰，但此時PBMC的EBV DNA檢測結(jié)果仍為陽性，提示血漿的檢測結(jié)果可以更好地明確EBV感染的實際狀態(tài)。

本研究存在一定的不足之處，為單中心、回顧性研究，未能對研究對象進行隨訪，因此無法對EBV抗體與DNA的變化進行動態(tài)監(jiān)測，后續(xù)將開展多中心、前瞻性的臨床研究，為EBV抗體及DNA檢測結(jié)果的意義判讀及臨床應用提供更多的理論依據(jù)。