HBB在肺癌組織中的表達及臨床意義*

徐鑫鑫，蔡 花，彭靜靜，劉紅利，褚福營△

1.南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇南通 226000；2.江蘇省南通市第一人民醫院檢驗科，江蘇南通 226000；3.江蘇省南通市腫瘤醫院檢驗科，江蘇南通 226000

肺癌在全球范圍內的發病率高，由于缺乏早期診斷方法，大部分肺癌患者被發現時已經處于中晚期[1]。因此尋找肺癌早期診斷的分子標志物成為臨床肺癌診斷和治療研究中迫切需要解決的問題。人血紅蛋白β(HBB)基因是血液中主要的珠蛋白基因，HBB可作為氧氣的轉運載體。近年來，隨著研究的深入，人們發現HBB除了參與血液疾病的發生、發展外[2]，其在腫瘤中也發揮著重要的作用。ONDA等[3]發現，HBB能抑制間變性甲狀腺癌KTA2細胞生長，這表明HBB基因可能是一種新型腫瘤抑制基因。目前，HBB在肺癌中的研究還相對較少，本研究通過收集56例肺癌患者癌組織及癌旁組織，檢測HBB的表達并分析其與肺癌臨床病理特征的關系，以期為肺癌發生、發展的機制研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年4月至2011年5月南通市腫瘤醫院收治的56例肺癌患者為研究對象，收集其經手術病理檢查證實的肺癌組織及相應癌旁組織(距離癌灶邊緣5 cm)標本，取材后立即放入-80 ℃冰箱保存。患者術前均未進行放化療及免疫治療。患者對本研究知情同意，本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。肺癌患者病理分期參照國際肺癌研究協會(IASLC)第七版TNM分期標準。

1.2儀器與試劑 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自德國Roche公司，反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Trizol試劑購自美國Ambion公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自上海生工生物工程有限公司，HBB引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，4 ℃離心機購自美國Sigma公司，-80 ℃冰箱購自海爾公司，微量核酸蛋白分析儀購自美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR檢測HBB表達 肺癌組織中加入Trizol試劑提取總RNA，反轉錄為cDNA。反應體系：4 μL 5×buffer，2 μL dNTP，1 μL OligodT，反轉錄酶RT、RI各1 μL，11 μL DEPC水及總RNA。反應條件：42 ℃ 60 min，72 ℃ 5 min。以cDNA為模板，β-actin為內參，引物均由廣州銳博生物科技有限公司設計及合成。HBB上游引物：5′-TCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTAC-3′，下游引物:5′-TTAGGCAGAATCCAGATGCTCAA-3′；β-actin上游引物:5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3′，下游引物:5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。采用SYBR Green法檢測HBB的表達水平，實驗中設置3個復孔。PCR反應體系共20 μL：2 μL反轉錄產物，各0.8 μL上下游引物,10 μL Mix體系和6.4 μL DEPC水。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和72 ℃延伸各30 s，共45個循環。用2-ΔΔCt法計算HBB的表達水平。

1.3.2臨床資料收集 收集56例肺癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結轉移情況、5年生存情況。

1.3.3Kaplan-Meier生存分析 登錄Kaplan-Meier Plotter數據庫(http://kmplot.com/analysis/)分析HBB與肺癌患者預后的關系。設置條件為(1)Gene：HBB；(2)Cancer：Lung cancer；(3)Split patients：median；(4)Survival：OS；(5)Follow up threshold：60 months。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0和Graphpad Prism5.0軟件進行數據分析。不符合正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示，兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)進行診斷效能評價；采用Kaplan-Meier法進行生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1肺癌組織中HBB表達水平 肺癌組織中HBB表達水平為7.035(2.339，13.580)，低于癌旁組織的20.120(5.284，72.830)，差異有統計學意義(U=813.0，P<0.05)。

2.2肺癌組織中HBB表達水平與肺癌患者臨床病理特征的關系 肺癌組織中HBB高表達12例，低表達44例。肺癌組織中HBB表達水平與性別和TNM分期有關(P<0.05)，而與年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤最大徑及是否有淋巴結轉移無關(P>0.05)。此外，僅追蹤到46例患者的5年生存情況，其中35例患者存活，11例患者死亡，肺癌組織中HBB表達水平與患者5年生存情況有關(P<0.05)，見表1。

表1 肺癌組織中HBB表達水平與肺癌患者臨床病理特征的關系(n)

續表1 肺癌組織中HBB表達水平與肺癌患者臨床病理特征的關系(n)

2.3HBB對肺癌的診斷價值 經ROC曲線分析，HBB診斷肺癌的曲線下面積(AUC)為 0.714(95%CI:0.648～0.834)，當最佳截斷值為11.91時，其診斷靈敏度為71.4%，特異度為69.6%。見圖1。

圖1 HBB診斷肺癌的ROC曲線

2.4HBB表達水平與肺癌患者預后的關系 Kaplan-Meier生存分析結果顯示，HBB低表達患者生存率明顯低于高表達患者(HR=0.77，95%CI：0.67～0.89，P<0.05)。見圖2。

圖2 HBB表達水平與肺癌患者預后關系的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

近年來，隨著多重靶向藥物的研發與應用，肺癌患者總體生存率有所提高，但其發病率和病死率仍居于惡性腫瘤首位。目前，已經明確報道了部分與肺癌相關的癌基因和抑癌基因，包括間變性淋巴瘤激酶(ALK)[4]、表皮生長因子受體(EGFR)[5]、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)[6]、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)[7]、p53[8]基因等，但還有許多潛在的基因尚未被發現。尋找新的分子標志物和治療靶點，對探討肺癌診斷、治療的新方向具有重要價值。

健康人的血紅蛋白是由兩個α鏈和兩個β鏈組成的四聚體，其主要參與氧氣運輸。最初的研究認為，血紅蛋白專一性表達于紅細胞系，但隨著研究的不斷深入，發現在多種非紅細胞系中也存在血紅蛋白鏈的表達，如神經細胞、腎小球系膜細胞、巨噬細胞和肝細胞等[3,9-10]。HBB是珠蛋白家族成員之一，可廣泛表達于人正常甲狀腺組織中[3]，且在鼠肺泡上皮細胞及內皮細胞中也均有表達[11]。近年來，HBB與腫瘤的關系引起了研究者的重視。HBB位于染色體11p15.5，BEPLER等[12]發現，該位點的缺失與非小細胞肺癌患者預后不良有關。在間變性甲狀腺癌中，HBB表達顯著下調，且過表達HBB能明顯抑制KTA2細胞的生長[3]。另外，外源性加入HBB也能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖[11]。以上研究表明，HBB在腫瘤的發生、發展中具有抑制作用。本研究發現，肺癌組織中HBB的表達水平明顯低于癌旁組織，這與RHO等[13]的報道一致。臨床病理特征分析表明，HBB的表達水平與肺癌患者的性別和TNM分期有關(P<0.05)，而與年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤最大徑及是否有淋巴結轉移無關(P>0.05)。ROC曲線分析顯示，HBB診斷肺癌的AUC為0.714，當最佳截斷值取11.91時，診斷靈敏度為71.4%，特異度為69.6%。這表明HBB可作為肺癌診斷的潛在分子標志物。

基因的表達變化受多種因素影響，如雜合性缺失、DNA甲基化、非編碼RNA調節及外界環境的變化等[14-15]。ONDA等[3]研究發現,在未分化甲狀腺癌中HBB的啟動子存在半甲基化，其導致HBB表達水平降低。氧化應激狀態下，活性氧(ROS)能夠以依賴Krüppel樣鋅指轉錄因子4(KLF4)的方式促進HBB的表達[16]。關于肺癌組織中是否也存在類似機制還需要進一步研究。目前，HBB在腫瘤發生、發展中的機制還不太明確。有研究發現，HBB能夠抑制神經母細胞瘤在肺組織中的微小轉移[11]。微小轉移灶內神經母細胞瘤可能通過分泌可溶性因子刺激肺泡內皮細胞及血管內皮細胞中HBB表達上調。這兩種細胞可能將HBB旁分泌至細胞外并與腫瘤細胞表面的HBB受體結合，進而以胞吞、胞飲的方式進入腫瘤細胞，激活轉化生長因子激酶1(TAK1)和p38信號通路，并下調細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化水平，最終導致轉移灶的腫瘤細胞生長抑制及凋亡[11]。另外，HBB在腫瘤的免疫逃逸機制中也可能具有一定的作用。HBB可作為腫瘤微環境中的相關抗原被T細胞識別，并導致T細胞向CD8+分化。BALB/c小鼠在接種HBB33-42多肽疫苗后可使其免受腫瘤細胞的攻擊，疫苗發揮的保護作用不是直接作用于腫瘤細胞，而是通過與血管周細胞中的HBB發生免疫應答反應，限制或破壞腫瘤相關血管的結構來達到抗腫瘤作用[17]。因此筆者推測，在某些外界因素的作用下，正常肺組織中HBB表達會下調，HBB表達下調一方面可能直接導致正常肺泡上皮細胞的惡性轉變，另一方面則可能導致體內免疫靶點的缺失，從而使腫瘤微環境朝著有利于腫瘤生長的方向發展，最終促進肺癌的發生、發展。但也有些研究持相反的觀點，有研究發現，在前列腺癌患者的尿液及口腔舌鱗狀細胞癌患者的唾液中都可以檢測到高水平的HBB[18-19]。ZHENG等[16]通過分析來源于乳腺癌、前列腺癌及非小細胞肺癌中的循環腫瘤細胞(CTC)發現，與原發部位的癌細胞相比，CTC中HBB的表達顯著升高，HBB能保護CTC免受ROS誘導的調亡，并促進CTC的遠處轉移。PONZETTI等[20]也發現，高表達HBB能促進乳腺癌細胞遷移和侵襲，且高表達HBB的人群總體生存率較低。而本研究顯示，低表達HBB的肺癌患者預后較差，這表明在不同的腫瘤中HBB可能發揮不同的生物學作用。本研究尚存在一些不足之處，一方面，本研究只在mRNA水平檢測了HBB的表達而沒有進行蛋白水平的檢測，因此，下一步將通過蛋白質免疫印跡及免疫熒光檢測技術，從蛋白水平進一步分析其表達情況；另一方面，本研究樣本量偏少，結果可能存在一定的偏倚，后續將擴大樣本量，對所得結果進行進一步驗證。