IRF4 通過(guò)JAK/STAT 信號(hào)通路調(diào)控糖尿病腎病炎癥進(jìn)展

邱月 董蘭 趙升 秦曙光 何鳳

糖尿病腎病（DN）是糖尿病全身性微血管病變常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其患病率占糖尿病患者的30%～40%，為我國(guó)終末期腎病（ESRD）的主要病因，已成為我國(guó)慢性疾病的防治重點(diǎn)，其具體的疾病機(jī)制也是目前的研究熱點(diǎn)。有研究表明，代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等多種病理過(guò)程在DN 的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而DN 的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，新的分子診斷及治療靶點(diǎn)亟待探索。基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)是由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄了大量的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)海量數(shù)據(jù)的挖掘和分析，可深入探索疾病進(jìn)程中的分子變化和功能聯(lián)系。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)方法，篩選DN 中差異表達(dá)基因（DEG）并分析相關(guān)通路和功能，尋找DN 發(fā)展過(guò)程中的重要分子并驗(yàn)證其表達(dá)，為進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制以及尋找靶向分子治療提供新思路和新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

從2019 年10 月至2021 年10 月廣州市第一人民醫(yī)院的病理活組織檢查 （活檢）標(biāo)本中收集6 例DN 腎組織（DN 組）以及6 例腎腫瘤切除術(shù)后癌旁正常組織（NC 組）。DN 組標(biāo)本來(lái)源患者年齡（57.5±2.0）歲、BMI（25.4±1.0）kg/m，診斷符合 《糖尿病腎臟疾病臨床診療中國(guó)指南》 （2021版）。NC 組標(biāo)本來(lái)源患者年齡（55.3±1.9）歲、BMI（24.6±0.9）kg/m。本研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：K2020-014-01），所有入組患者均已簽署知情同意書。活組織離體后，均立即放入液氮，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二、生物信息學(xué)分析

使用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA 測(cè)序圖譜GSE142025進(jìn)行基因表達(dá)分析，其中包含對(duì)照組9 例與進(jìn)展期DN（aDN 組）21 例。應(yīng)用基于R 語(yǔ)言4.0.3 版的limma 包對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行差異表達(dá)分析，可視化NC 組與aDN 組之間的DEG，以差異倍數(shù)（FC）取log的絕對(duì)值（|logFC|）＞ 1 且調(diào)整后P ＜0.05 為DEG 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，其中|logFC| ＞ 2 且調(diào)整后P ＜ 0.01 為明顯上調(diào)或下調(diào)。基因集富集分析（GSEA）是用來(lái)評(píng)估一個(gè)預(yù)先定義基因集中的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢(shì)，從而判斷其對(duì)疾病的作用。采用GSEA 以歸一化富集得分（NES）絕對(duì)值＞1、P ＜ 0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR） ＜ 0.25 為篩選條件，利用R 語(yǔ)言進(jìn)行DEG功能富集。京都基因和基因組百科全書（KEGG）是一個(gè)信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)參與疾病發(fā)病機(jī)制中重要的信號(hào)通路進(jìn)行注釋。使用String （https://cn.string-db.org/）和Cytoscape 3.8.0 可視化中樞（hub）基因之間的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

三、定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證DEG mRNA 表達(dá)

使用TRIzol 試劑（Thermo，美國(guó)）提取2 組標(biāo)本的總RNA，經(jīng)NanoDrop 檢測(cè)純度后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA，隨后使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 試 劑 盒 進(jìn) 行RT-qPCR 檢 測(cè)DEG mRNA 表達(dá)，每組樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，2法計(jì)算熒光強(qiáng)度閾值（Ct 值），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，檢測(cè)樣品目的基因相對(duì)表達(dá)量。

四、過(guò)碘酸-希夫（PAS）染色和鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（SP）染色驗(yàn)證差異基因蛋白表達(dá)

常規(guī)石蠟包埋2 組腎組織，4 μm 厚連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟、水化后分別采用PAS 染色和SP 染色。PAS 染色為先取過(guò)碘酸溶液氧化，樣品滴加希夫試劑染色后去除染色液，再用蘇木素染色，自來(lái)水沖洗后常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下拍照。SP 法為3% HO封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，加入正常山羊血清封閉內(nèi)源性生物素，室溫孵育10 min 后甩干，滴加一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日取出切片滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、差異基因表達(dá)

通過(guò)R 語(yǔ)言分析和篩選GSE14202 中的DEG，得到1213 個(gè)DEG。與對(duì)照組相比，aDN 組有684個(gè)基因上調(diào)、529 個(gè)基因下調(diào)，見(jiàn)圖1A。明顯上調(diào)或下調(diào)共50 個(gè)DEG，見(jiàn)圖1B。

圖1 對(duì)照組與aDN 組間差異表達(dá)的DEG

二、GSEA 功能富集

使用R 語(yǔ)言分析對(duì)照組與aDN 組之間的通路富集，其中酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、Fcγ受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬作用信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路明顯激活，見(jiàn)圖2。明顯上調(diào)的KEGG 富集通路多與炎癥分子及免疫反應(yīng)過(guò)程相關(guān)，提示IFN 調(diào)節(jié)因子4 （IRF4）等明顯上調(diào)基因可能通過(guò)炎癥相關(guān)通路參與DN 的發(fā)生發(fā)展。

圖2 aDN 組中上調(diào)的GSEA 功能富集通路

三、PPI 構(gòu)建及hub 基因表達(dá)驗(yàn)證

將篩選所得的DEG 數(shù)據(jù)集導(dǎo)入String 網(wǎng)址進(jìn)行分析，并用Cytoscape 軟件可視化得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。PPI 網(wǎng)絡(luò)中紅色為上調(diào)基因，藍(lán)色為下調(diào)基因，可見(jiàn)IRF4、信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子6（SLAMF6）、趨化因子受體4（CCR4）和IL-2 受體α 亞基（IL-2RA）作為hub 基因表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖3A。隨后使用RT-qPCR 檢測(cè)hub 基因在NC 組和DN 組腎組織中的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示DN 組腎組織中IRF4（t = 25.46，P ＜ 0.001）、SLAMF6（t = 15.31，P ＜ 0.001） 和IL-2RA（t = 19.86，P ＜ 0.001）mRNA 均高于NC 組腎組織，見(jiàn)圖3B。PAS 及SP染色檢測(cè)目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，得到與RT-qPCR一致的結(jié)果，見(jiàn)圖3C。

圖3 hub 基因的篩選及其在DN 腎組織中的mRNA 和蛋白表達(dá)

討 論

DN 是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，30%～40%的糖尿病患者伴腎損傷。DN 是老年人慢性腎臟病的主要病因，近年在我國(guó)發(fā)病率急劇上升，已成為ESRD 的第二大病因。研究表明，多條信號(hào)通路與 DN 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）的形成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法，篩選并分析aDN 組和對(duì)照組之間的DEG。在篩選出的1213 個(gè)DEG 中，與對(duì)照組相比，aDN 組684個(gè)基因上調(diào)、529 個(gè)基因下調(diào)。KEGG 通路富集分析顯示，JAK/STAT信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、Fcγ 受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬作用信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等炎癥相關(guān)通路激活，與既往報(bào)道一致，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子及趨化因子異常表達(dá)在DN 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

JAK/STAT 信號(hào)通路主要由JAK 相關(guān)受體、JAK 和轉(zhuǎn)錄因子三部分組成，在機(jī)體中發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并且活化相應(yīng)靶基因，進(jìn)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。在DN中，高血糖、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）、AGE、活性氧、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他上游信號(hào)均可激活JAK/STAT 信號(hào)通路。Yu 等發(fā)現(xiàn)AGE的累積可上調(diào)JAK2/STAT3 信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和足細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)DN 的發(fā)生。此外，研究表明高血糖狀態(tài)可以通過(guò)Ang Ⅱ增加及活性氧誘導(dǎo)活化JAK2/STAT3 信號(hào)通路，使腎小球系膜細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)TGF-β 分泌，增加細(xì)胞外基質(zhì)生成，引起腎臟損傷。Ortiz-Mu?oz 等向DN 大鼠模型腎內(nèi)注射質(zhì)粒和腺病毒載體，局部過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1（SOCS1）及SOCS3 蛋白負(fù)性調(diào)控JAK/STAT 信號(hào)通路活化，可明顯減輕DN 大鼠腎臟的炎癥和纖維化。隨后，Hu 等研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)趨化因子C1q/TNF 相關(guān)蛋白3 可通過(guò)下調(diào)JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制系膜細(xì)胞增殖和活性氧水平，從而減輕DN 的進(jìn)展。以上結(jié)果提示JAK/STAT 信號(hào)通路在DN 的炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

IRF 是一類通過(guò)介導(dǎo)IFN 轉(zhuǎn)錄、參與免疫調(diào)控作用于多種生物學(xué)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子。IRF4 為IRF 家族中的一員，其限制表達(dá)于免疫細(xì)胞，在T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的成熟及調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞功能發(fā)揮中是必需的。IRF4 既可作為轉(zhuǎn)錄激活因子也可作為抑制因子，這取決于它與不同轉(zhuǎn)錄因子或特定啟動(dòng)子上的 DNA 結(jié)合域的相互作用。IRF4 參與多種炎癥性疾病的病理過(guò)程，在炎癥性腸病中，IRF4 可以促進(jìn)IL-6 的產(chǎn)生，而IL-6在T 淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)STAT3 的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡繼而引起腸道炎癥。同時(shí)，IRF4 也與多種腎臟疾病的發(fā)展關(guān)系密切，在慢性腎病小鼠模型中，IRF4 通過(guò)促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞的極化、限制1 型輔助性T 淋巴細(xì)胞活化和細(xì)胞因子表達(dá)，限制缺血性腎損傷后的慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化。而一項(xiàng)原發(fā)性膜性腎病的研究中則發(fā)現(xiàn)腎足細(xì)胞中NF-κB 的異常激活和IRF4 的表達(dá)同步上調(diào)。此外，據(jù)報(bào)道顯示，過(guò)表達(dá)miR-15b 可特異性下調(diào)IRF4 以抑制濾泡輔助T 淋巴細(xì)胞的增殖和成熟來(lái)緩解急性腎損傷，從而改善腎移植術(shù)后急性腎損傷的發(fā)生。最近的研究表明，IRF4 缺乏可減少葉酸所誘導(dǎo)的急性腎損傷后的炎癥和腎纖維化。在IL-21 誘導(dǎo)的STAT3 和 IRF4 結(jié)合位點(diǎn)的全基因組 ChIP-Seq 結(jié)果中顯示，超過(guò)70%的STAT3 結(jié)合區(qū)域與IRF4 共定位，提示STAT3 與IRF4 存在廣泛的協(xié)同作用。本研究顯示，IRF4 作為hub 基因在DN 組織中表達(dá)明顯上調(diào)，hub 基因功能富集多聚焦于炎癥及免疫相關(guān)通路，提示IRF4 可能作為DN 發(fā)病的潛在分子，通過(guò)JAK/STAT 信號(hào)通路在炎癥過(guò)程及免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，對(duì)其深入研究可為DN 的臨床策略提供新的治療靶點(diǎn)。

本研究利用生物信息學(xué)篩選并分析aDN 組和對(duì)照組之間的DEG 并進(jìn)行功能富集，發(fā)現(xiàn)IRF4作為hub 基因在DN 中表達(dá)上調(diào)，RT-qPCR 及SP染色驗(yàn)證其在DN 腎組織中明顯上調(diào)，結(jié)合生物信息分析結(jié)果提示其可能通過(guò)JAK/STAT 信號(hào)通路參與DN 的炎癥過(guò)程及免疫反應(yīng)，但具體的作用機(jī)制仍需大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其為進(jìn)一步闡明DN 發(fā)病機(jī)制提供新的潛在的分子機(jī)制，為DN 的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。