miRNA-10 對(duì)人胰腺癌PANC-1 細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及在胰腺癌中的表達(dá)

劉玉蘭，何鳳屏，黃從云，李定云

廣東省汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512025

胰腺癌（pancreatic cancer，PaCa）是消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其致死率極高[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)胰腺癌研究明顯落后于肝、胃、腸道腫瘤，胰腺癌的5年生存率不足5%[2]。臨床常用血清標(biāo)志物CEA、CA-199、CA-242 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胰腺癌診斷的靈敏度僅為30%~50%[3]。迫切需要尋找胰腺癌敏感性和特異性高的標(biāo)志物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。雖然miRNA-10 調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]，但其在調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡目前未見有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)選擇2017年3月—2019年9月在粵北人民醫(yī)院腫瘤中心肝膽外科手術(shù)治療的80例經(jīng)病理診斷為胰腺癌患者為研究對(duì)象，研究miRNA-10 對(duì)PANC-1 細(xì)胞株生物學(xué)功能的影響，皆在為PaCa 的臨床診療提供新的思路和新靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在本院病理診斷證實(shí)為PaCa 患者80例，其中男50例，女30例；年齡37~68歲，平均（57.91±5.36）歲。所有患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)藥物、免疫治療。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）和國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）胰腺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[5]：Ⅰ期3例，Ⅱ期17例，Ⅲ期50例。另取同期健康體檢者80名作為對(duì)照，年齡45~65歲，平均（56.39±5.24）歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象簽約知情同意書，且通過(guò)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒、PCR 引物購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司，主要儀器采用美國(guó)BIO-RAD CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀。

1.3 方法

1.3.1 集血漿標(biāo)本所有研究對(duì)象均在入選次日清晨7：30 am 空腹，抽取靜脈血檢測(cè)常規(guī)腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)抽取5 mL 靜脈血置于乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA）試管中，立即送到實(shí)驗(yàn)室提取DNA或RNA，并放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錂z。

取胰腺癌組織及癌旁正常腸黏膜組織（距離腫瘤邊緣至少5~6 cm），離體10 min 內(nèi)放入液氮保存，用于提取總RNA。

1.3.2 總RNA 提取血漿總RNA 的提取嚴(yán)格按照RNA 提取試劑說(shuō)明書進(jìn)行提取血漿總RNA。通過(guò)使用紫外分光光度儀測(cè)定所提取RNA 的濃度及純度，并計(jì)算RNA濃度。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)嚴(yán)格按照特異性反轉(zhuǎn)錄引物的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分別檢測(cè)各組miRNA-10 的表達(dá)，同時(shí)也檢測(cè)各細(xì)胞中PTEN mRNA 的表達(dá)情況，并作相關(guān)分析，以U6 為內(nèi)參照，用2-△Ct 法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。在BIO-RAD CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行熒光擴(kuò)增和檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用消化法培養(yǎng)將人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，分為兩組：一組加入胰腺癌細(xì)胞，另一種為正常胰腺細(xì)胞，分別加入miRNA-10 誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h 后觀察兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

采用Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和MTT 法分別檢測(cè)miRNA-10 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的侵襲能力，評(píng)估m(xù)iRNA-10 調(diào)控PTEN 促PaCa 細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和遷移作用。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：選擇合適的混合比例（1∶1-1∶2/脂質(zhì)體體積：DNA 質(zhì)量）來(lái)轉(zhuǎn)染PANC-1 細(xì)胞。

Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：PANC-1 細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)后6 h，消化、計(jì)數(shù)，吹打至1×105個(gè)/mL。取500 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室中，下室加入1 mL 培養(yǎng)基；培養(yǎng)后24 h 計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3 復(fù)孔，取平均值。

1.4 預(yù)測(cè)miRNA-10 靶基因

采用TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 生物信息軟件預(yù)測(cè)miRNA-10 靶基因，初步認(rèn)為PTEN 基因是miRNA-10 靶基因

1.5 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，制備miRNA-10 mimics 結(jié)合重懸細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)Annexin V 抗體與磷脂絲氨酸（phospholipid serine, PS）的特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 FCM 法檢測(cè)細(xì)胞周期變化

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度miRNA-10 mimics，離心收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)DNA 周期變化。

1.7 觀察指標(biāo)

①觀察miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中的表達(dá)水平；②觀察miRNA-10 在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平；③觀察胰腺癌細(xì)胞系中miRNA-10 與PTEN 的 關(guān) 系；④miRNA-10 過(guò) 表 達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；⑤miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞增殖的影響；⑥miRNA-10 mimics過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞遷移的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman 分析CRC 患者血清miRNA-10 與PTEN 表達(dá)水平的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中表達(dá)分析

在胰腺癌患者血漿和組織中miRNA- 10 明顯增高，分 別 為（3.56±1.43）和（4.28±1.57），對(duì) 照 組 為（0.43±0.27），經(jīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），分析兩者呈正相關(guān)（r=0.943，P<0.01）。

2.2 miRNA-10 在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)分析

提取10例胰腺切緣處無(wú)腫瘤病灶正常黏膜組織PANC-1 細(xì)胞，分析轉(zhuǎn)染miRNA-10 mimics 后的miRNA-10 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染miRNA-10 mimics 后的miRNA-10 的表達(dá)水平是陰性與對(duì)照組的5 000 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

2.3 胰腺癌細(xì)胞系中miRNA-10 與PTEN 的關(guān)系分析

在數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 等初步選定PTEN 為miRNA-10 的靶基因，通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞中miRNA-10 與PTEN的表達(dá)水平分析兩者的相關(guān)性，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.916，P<0.01）。

2.4 miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞的影響分析

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的miRNA-10 mimics組 分 別12、24、36、48 和60 h 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為（11.8±1.87）、（17.34±2.23）、（23.17±2.36）、（31.56±3.11），均高于陰性與對(duì)照組（4.96±1.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的加速作用。

2.5 miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞增殖的影響分析

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析miRNA-10 mimics 轉(zhuǎn)染2 周后細(xì)胞克隆數(shù)為（380±84）個(gè)，明顯高于陰性與對(duì)照組（140±17）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），miRNA-10過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)的影響。

2.6 miRNA-10 mimics 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞遷移的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-10 mimics 轉(zhuǎn)染2 周后，觀察到PANC-1 細(xì)胞遷移能力的變化，在miRNA-10 mimic 組（321.43±17.34）明 顯 快 于 對(duì) 照 組（85.43±11.67），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。圖1 表示Transwell 實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染miRNA-10 mimics 后對(duì)PANC-1 細(xì)胞遷移能力的影響，在加入miRNA-10 mimics 后顯示細(xì)胞遷移能力明顯加快，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（***P<0.001）。

圖1 miRNA-10 mimics 對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Figure 1 The effect of miRNA-10 mimics on cell migration ability

2.7 miRNA-10 inhibitor 對(duì)PANC-1 細(xì)胞凋亡率的影響分析

miRNA-10 inhibitor 轉(zhuǎn)染PANC-1 細(xì)胞48 后，F(xiàn)CM 法檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和miRNA-10 inhibitor 組細(xì)胞凋亡率分別為（14.87±1.51）%和（33.66±2.95）%，細(xì)胞凋亡率在陰性對(duì)照組明顯低于miRNA-10 inhibitor 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。圖2 表示miRNA-10 inhibitor 對(duì)PANC-1 細(xì)胞凋亡率的影響，在轉(zhuǎn)染miRNA-10 inhibitor 后顯示細(xì)胞凋亡率增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）。

圖2 miRNA-10 inhibitor 對(duì)PANC-1 細(xì)胞凋亡率的影響Figure 2 The effect of miRNA-10 inhibitor on the apoptosis rate of PANC-1 cells

2.8 miRNA-10 inhibitor 對(duì)PANC-1 細(xì)胞周期各時(shí)期影響分析

FCM 法檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與miRNA-10 inhibitor 組在G1 期、S 期和G2 期細(xì)胞所占比例分（36.60%vs 27.48%）、（45.67% vs 53.06%）、（17.73% vs 19.46%），兩組比較，miRNA-10 inhibitor 組G1 期細(xì)胞所占比例明顯減少，S 期細(xì)胞所占比例明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖3A、圖3B。miRNA-10 inhibitor 組誘導(dǎo)PANC-1 細(xì)胞在G1/S 期增殖，顯示miRNA-10 表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞周期分布的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-10 的表達(dá)與肺癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)病有密切關(guān)系[5]，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移這一方面起重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-10 在PaCa 患者血漿中水平升高，腫瘤切除后水平明顯下降。近期研究顯示，miRNA-10 在細(xì)胞株和PaCa 患者組織呈高表達(dá)水平，并與患者生存率呈反比，認(rèn)為miRNA-10 與PaCa的侵襲力密切相關(guān)[6]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CRC 患者血漿和組織中miRNA-10 的表達(dá)明顯上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-10 與PaCa 病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著腫瘤惡性度的升高，miRNA-10 表達(dá)逐步增高，尤其在TⅢ、TⅣ期間的增高特別明顯，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05；P<0.01）。

目前，有多項(xiàng)研究表明，miRNA-10 作為促癌因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期（S 期）。AguennouzM 等[7]報(bào)道m(xù)iRNA-10 在各種類型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均表達(dá)上調(diào)，并與多病灶腫瘤及擴(kuò)散有密切關(guān)聯(lián)，提示促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；在另一些腫瘤組織表達(dá)為下調(diào)[8]。本文顯示轉(zhuǎn)染miRNA-10 mimics 后的胰腺癌PANC-1 細(xì)胞克隆數(shù)目明顯增加，細(xì)胞生長(zhǎng)加快，表明miRNA-10 可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。在FCM 法檢測(cè)時(shí)觀察到，下調(diào)miRNA-10 表達(dá)后，PANC-1 細(xì)胞凋亡率顯著提高。本研究認(rèn)為，miRNA-10 誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移可能通過(guò)影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡的機(jī)制。

PTEN 基因主要通過(guò)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和遷移等環(huán)節(jié)發(fā)揮抑癌功能。本研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-10 inhibitor 發(fā)現(xiàn)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞中miRNA-10 的表達(dá)下調(diào)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miRNA-10 能刺激PTEN 表達(dá)上調(diào)。本研究組推測(cè)miRNAs可能通過(guò)下調(diào)PTEN通路抑制PaCa 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PTEN 是腫瘤抑制基因，具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸活性，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、血管生成、細(xì)胞侵襲和遷移等方面起到重要作用[9]。本研究初步在PaCa細(xì)胞中檢測(cè)miRNA-10和PTEN的表達(dá)水平，隨著miRNA-10 表達(dá)的增加，PTEN 基因表達(dá)下調(diào)，提示在PaCa 中miRNA-10 和PTEN 可能存在特殊的相互作用。

綜上所述，miRNA-10 可以促進(jìn)PaCa 細(xì)胞的增殖和調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，提示miR-10-PTEN 通路可能作為未來(lái)潛在的PaCa 抗癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移療法的新靶點(diǎn)，另一方面也可以作為臨床診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的新分子標(biāo)志物。