廣東省豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定及耐藥表型和耐藥基因檢測與分析

徐民生，柯海意，施科達，楊冬霞，翟少倫，臧瑩安，李春玲

(1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣州 510305；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所,廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640)

中國是世界上重要的豬肉生產國和消費國，廣東省作為全國重要的產豬大省，其規模和出欄量均位于全國前列。自2019年國家農業農村部準備實施“飼料禁抗”政策以來，傳統養殖模式的改變也加大了病原菌在養殖場內傳播的風險[1-2]。在引起豬呼吸道疾病的幾類傳染病中，由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia，PCP)在世界范圍內造成了較高的發病率和死亡率[3]。APP是一種定植于豬上呼吸道的革蘭氏陰性、無運動的桿狀細菌，主要導致發病豬出現急性或慢性的壞死性-纖維素性胸膜肺炎，給養豬業造成重大的經濟損失[4]。

根據 APP 生長對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的依賴性，將其分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[5]。同時以莢膜多糖的抗原特性將該物種分為19種血清型,眾多的血清型及區域流行的差異、暫無高效安全的疫苗及耐藥菌株的出現，給APP的防控和治療帶來了巨大的挑戰[6-7]。發病豬被認為是最主要的傳染源，且在<1 m的短距離中APP也會隨著空氣進行傳播，所有年齡的豬均會感染，特別是3月齡的育肥豬最易感染，且通常會導致較高的發病率和死亡率[8-9]。使用抗生素是目前最主要的預防和治療手段，但抗生素的濫用導致APP對常用抗生素的耐藥性(AMR)日益嚴重，且越來越多的多重耐藥菌株也為臨床治療和防控該疾病帶來了很大困擾[10]。已有研究表明，對豬的最佳治療和謹慎使用抗生素是防止關鍵耐藥性發展和確保動物健康的必要條件,某些細菌的耐藥性也會隨著使用情況和時間的推移發生變化[11]。因此，對豬致病菌耐藥性的持續監測顯得十分必要。

為了解和掌握近3年廣東省內規模化豬場APP感染和耐藥的情況，本研究以疑似APP感染病豬為研究對象，分別進行APP的分離鑒定、藥敏試驗及耐藥基因的檢測，并進一步分析耐藥表型和耐藥基因的關系，以期為臨床上防治APP提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌株 2019-2021年采集廣東省不同地區不同規模化豬場疑似感染豬傳染性胸膜肺炎的病死豬的肺臟、肝臟等組織。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白大豆瓊脂培養基(TSA培養基)、胰蛋白大豆肉湯培養基(TSB培養基)、普通綿羊血平板(廣東環凱微生物科技有限公司)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(北京索萊寶科技有限公司)；小牛血清(廣州蕊特生物科技有限公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×rTaqMix、DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；革蘭氏染液、生化反應管和藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)。

電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司產品)；PCR儀(杭州晶格科學儀器有限公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養及形態觀察 無菌采集病死豬組織病料，使用接種環無菌接種于TSA固體培養基(含10%小牛血清及0.1% NAD)上，于37 ℃過夜培養，觀察并記錄菌落形態，挑取疑似單菌落接種于TSB液體培養基中進行純化培養。并對純化后的菌落進行涂片和革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察并記錄菌體形態。

1.2.2 生化鑒定試驗 將分離菌株的液體培養物分別接種于添加了0.1% NAD的生化反應管中，37 ℃培養24 h，觀察其生化反應特性并按照說明書進行鑒定。

1.2.3 APP菌種的PCR鑒定 參考王海麗等[12]合成APP菌種特異性靶基因OmlA的引物。引物序列為：F：5′-AAGGTTGATATGTCCG-CACC-3′；R：5′-CACCGATTACGACTTGCC-3′，預期擴增片段長度為952 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用試劑盒提取DNA并以此為模板進行PCR反應。PCR 反應體系25 μL：2×rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收陽性PCR產物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 相似性及進化樹分析 將測序結果在GenBank進行BLAST比對。選取NCBI數據庫中與APP相似性相近的10條序列(表1)，用Mega 7.0 軟件對選取的序列進行編輯，并構建系統進化樹。

表1 參考菌株信息

1.2.5 藥敏試驗 采用K-B藥敏紙片法對分離菌株進行藥敏試驗。將分離菌株接種至含有10%小牛血清及0.1% NAD的TSB培養基中，制成含菌量約為0.5麥氏濁度的菌懸液，吸取100 μL并用無菌棉簽均勻涂布于TSA平板(含0.1% NAD和10%小牛血清)表面，待液體吸干后用無菌鑷子夾取抗生素藥敏紙片貼在平板表面，置于37 ℃溫箱中培養30 min，后倒置培養12～18 h，記錄抑菌圈直徑并參照杭州微生物試劑有限公司提供的判斷標準，判定分離菌為耐藥(R)、中介(I)和敏感(S)。

耐藥率(%)=對某種抗菌藥物耐藥的菌株數/總菌株數×100%

耐藥表型率(%)=對某類抗菌藥物耐藥的總菌株數/檢測某類抗菌藥物的總菌株數×100%

1.2.6 耐藥基因檢測 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA作為PCR反應模板，于-20 ℃保存備用。根據細菌耐藥情況及參考相關文獻[13-19]報道，設計合成7類23種耐藥基因引物并進行檢測，包括：β-內酰胺類blaCMY、blaOXA、blaSHV、blaTEM基因；氨基糖苷類ant(6′)-Ⅰa、aph(2″)-Ⅰb、aph(2″)-Ⅰc和aph(2″)-Ⅰd基因；大環內酯類和林可胺類mefA、ermA、ermB基因；磺胺類sul1、sul2和sul3基因；四環素類tetA、tetB、tetM、tetO和tetR基因；喹諾酮類gyrA和parC基因；氯霉素類floR和fexA基因。引物信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系25 μL：2×rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；95 ℃變性40 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共40個循環；72 ℃延伸 10 min，PCR 產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

耐藥基因攜帶率(%)=對某種耐藥基因的陽性菌株數/總菌株數×100%

耐藥基因平均攜帶率(%)=對某類抗菌藥物的總攜帶率/某類抗菌藥物耐藥基因總數×100%

耐藥基因與耐藥表型相符率(%)=耐藥基因平均攜帶率/耐藥表型率×100%

表2 耐藥基因引物信息

續表

2 結 果

2.1 細菌分離結果

在TSA(含NAD)平板上分離出圓形、小而透明的露珠樣黏液型菌落(圖1)，革蘭氏染色結果顯示分離菌為革蘭氏陰性菌，多成短桿狀，兩極著色明顯(圖2)，共獲得20株分離菌。

圖1 分離菌菌落形態Fig.1 Colony morphology of the isolated bacteria

圖2 分離菌革蘭氏染色結果(1 000×)Fig.2 Gram staining results of the isolated bacteria (1 000×)

2.2 生化試驗結果

生化試驗結果顯示，20株分離菌對葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、甘露醇、尿素酶和硝酸鹽還原酶的反應為陽性；蕈糖、棉子糖、血清菊糖、山梨醇、水楊素和七葉苷反應為陰性(表3)。生化試驗結果與APP生化特性一致，可初步確定分離菌為APP。

表3 20株臨床分離菌株生化鑒定結果

2.3 分離菌株PCR鑒定

采用針對APP菌種的特異性引物進行OmlA基因擴增，結果顯示，分離株均獲得長度為952 bp的特異性條帶(圖3)，與預期結果相符。本試驗共成功分離到20株APP，分別將其命名為GD1901～GD1908、GD2009～GD2014、GD2115～GD2120，并保存于廣東省農業科學院動物衛生研究所豬病研究室。

M，DL2000 DNA Marker；-，陰性對照；+，陽性對照；1～20，分離株M，DL2000 DNA Marker;-，Negative control;+，Positive control;1-20,The isolates圖3 分離株OmlA基因PCR鑒定結果Fig.3 PCR identification results of OmlA gene of the isolates

2.4 序列相似性及系統進化分析

20株APP分離菌株經OmlA基因擴增后進行測序，將測序結果與參考菌株進行序列相似性分析，結果顯示，分離菌株與已發表的10株APP序列相似性在98%～100%之間。系統進化分析結果顯示，APP廣東分離株GD1904、GD2119、GD1905、GD2117、GD2118、GD2116與APP瑞士分離株WF83和德國分離株AP76親緣關系較近，聚成一簇，并與中國分離株JL03和美國分離株NCTC11384處在同一分支；GD1901、GD1902、GD1903進化關系較近，并與巴西分離株MV279和加拿大分離株L20處在同一分支；GD1906、GD1907親緣關系較近，GD2115、GD2009、GD2011、GD2014、GD2010、GD2012、GD2013的進化關系較近，促成一簇并與丹麥分離株NCTC10976和愛爾蘭分離株S405處在同一分支；GD1908和GD2120都與韓國分離株KL16處在同一分支(圖4)。

圖4 APP分離株OmlA基因系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of OmlA gene of APP isolates

2.5 藥物敏感性鑒定

藥敏結果顯示，分離的20株APP菌株對臨床上常用的18種抗菌藥物產生不同程度的多重耐藥性，對青霉素、克拉霉素、磺胺異噁唑、四環素和林可霉素5種藥物的耐藥率最高，達到70%～100%；對氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、復方新諾明、多西環素和氟苯尼考6種藥物的耐藥率為30%～60%；對頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻肟(凱福隆)、卡那霉素、紅霉素、環丙沙星和恩諾沙星7種藥物耐藥率較低，為10%～25%；其中對頭孢唑啉(先鋒Ⅴ)、阿奇霉素2種藥物敏感(表4)。

多重耐藥情況的統計結果顯示，分離菌均呈現多重耐藥性(表5)。其中10重及以上耐藥的菌株最多，有7株，占比達到35%，9重和8重耐藥菌株占比分別達到10%和5%，由此可見約50%分離菌株為8重及以上耐藥；6重和7重耐藥菌株也較多，共有8株，占比達到40%；5重耐藥菌株數占比較少，為10%。統計結果表明，分離的20株APP的多重耐藥情況十分嚴重。

表5 APP臨床分離株的多重耐藥情況

2.6 耐藥基因檢測結果

耐藥基因檢測結果顯示，20株APP中β-內酰胺類中blaCMY基因攜帶率最高，為85%(17/20)，blaOXA、blaTEM、blaSHV基因均未檢測出；氨基糖苷類中aph(2″)-Ⅰb基因攜帶率最高，為85%(17/20)，aph(3″)-Ⅲa、ant(6′)-Ⅰa、aph(2″)-Ⅰc和aph(2″)-Ⅰd基因未檢測出；氯霉素類中floR基因攜帶率最高，為80%(16/20)，未檢測到fexA基因；磺胺類sul3基因攜帶率最高，為75%(15/20)，sul1和sul2耐藥基因攜帶率分別為50%(10/20)和60%(12/20)；四環素類中tetB和tetO基因攜帶率最高，為100%(20/20)，tetM基因攜帶率為85%(17/20)，tetR基因攜帶率為70%(14/20)，tetA基因攜帶率為30%(6/20)；未檢測出大環內酯類和喹諾酮類相關耐藥基因。部分凝膠電泳結果見圖5～7。

①A～C，分別為blaCMY、aph(2″)-Ⅰb和floR基因。②M，DL2000 DNA Marker；1～8，GD1901～GD1908；9～14，GD2009～GD2014；15～20，GD2115～GD2120。下同①A-C，blaCMY，aph(2″)-Ⅰb and floR genes,respectively；②M，DL2000 DNA Marker；1-8，GD1901-GD1908；9-14，GD2009-GD2014；15-20，GD2115-GD2120.The same as below圖5 blaCMY、aph(2″)-Ⅰb和floR耐藥基因PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of blaCMY,aph(2″)-Ⅰb and floR resistance genes

A～C,分別為sul1、sul2和sul3基因A-C,sul1,sul2 and sul3 genes,respevtively圖6 磺胺類耐藥基因PCR擴增結果Fig.6 PCR amplification results of sulfonamides resistance genes

A～E,分別為tetA、tetB、tetM、tetO和tetR基因A-E,tetA,tetB,tetM,tetO and tetR genes,respectively圖7 四環素類耐藥基因PCR擴增結果Fig.7 PCR amplification results of tetracyclines resistance genes

2.7 耐藥表型與耐藥基因相關性

在檢測的20株APP中，耐藥表型不同程度地高于相應耐藥基因的攜帶率(表6)。分離株對磺胺類和四環素類藥物表現出較高程度的耐藥性，同時磺胺類耐藥基因(sul1、sul2和sul3基因)和四環素類耐藥基因(tetB和tetO基因等)的陽性檢出率也較高，表現較為一致，相符率達到94.9%和99.4%；β-內酰胺類、氨基糖苷類和的耐藥表型和耐藥基因的攜帶率均較低，為20%～40%；氯霉素類藥物中針對氟苯尼考藥物的耐藥基因(floR基因)檢出率較高，與藥物的耐藥表型也基本一致；而對大環內酯類、林可胺類和喹諾酮類沒有檢測到相關的耐藥基因，但在表型上表現出一定的耐藥率，分別為31.7%、100%和15%。

表6 分離株APP耐藥基因與耐藥表型相關性

3 討 論

豬傳染性胸膜肺炎被認為是世界范圍內工業化養豬的三大呼吸道疾病之一[20]，目前商業疫苗只能提供有限的保護，抗生素的使用依然是臨床上治療該病的有效措施，但由于長期以來抗生素的濫用導致許多耐藥菌株的出現[21]，世界衛生組織更是將耐藥性列為世界公共衛生的三大威脅之一[11]。因此，進行流行病學跟蹤以明確APP的耐藥譜和耐藥基因的攜帶率對臨床上科學的指導用藥和減少耐藥性的產生具有重要意義。

本試驗針對廣東省不同地區豬場分離得到20株APP，經PCR擴增OmlA基因(OmlA基因為APP外膜脂蛋白的種特異性靶基因，可準確快速地鑒定細菌[12])鑒定后測序，測序結果與NCBI上選取的10株參考菌株進行BLAST比對，相似性達98%以上。進化樹結果顯示,分離株GD1904、GD2119、GD1905、GD2117、GD2118、GD2116與中國分離株JL03親緣關系較近，處在同一分支；其他分離株分別與不同國家的APP分離株有進化關系，表明20株APP可能由于在地理位置上分布廣，沒有表現出明顯的地域特性和物種特性。

本研究針對臨床上常用的20種抗菌藥，對分離株分別進行7大類23種耐藥基因和耐藥表型檢測，結果顯示，20株分離菌除了對阿奇霉素和頭孢唑啉(先鋒Ⅴ)完全不耐藥外，對青霉素等其他抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，對磺胺異噁唑、林可霉素和四環素高度耐藥，耐藥率為100%；對氨芐西林、慶大霉素等6種藥物較耐藥，耐藥率為30%～60%；對阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻肟(凱福隆)等7種藥物耐藥率較低，為10%～25%。Kucerova等[22]報道捷克APP分離菌株對氟苯尼考、阿莫西林-克拉維酸藥物耐藥性較低，而對四環素耐藥性較高，為23.9%；Kim等[23]和Archambault等[24]報道的APP分離菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥性低；王丹丹等[21]檢測蘇中地區APP藥敏結果顯示，分離菌株對β-內酰胺類藥物高度敏感，對鏈霉素耐藥；余波等[25]分析貴州省APP耐藥表型的結果顯示，分離菌株對四環素及磺胺類藥物耐藥，但對氟苯尼考敏感。通過比較可發現，廣東地區分離株的耐藥表型與國內其他地區相似，但與國外差異較大，其中四環素類的耐藥性大幅增加，氟苯尼考的耐藥性也有所變化，這可能由于四環素耐藥菌株的不斷進化和臨床上對氟苯尼考的使用頻率加大導致APP菌對該藥物的耐藥率增加。耐藥基因方面，本研究共檢測到blaCMY、aph(2″)-Ⅰb、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetM、tetO、tetR和floR共11種耐藥基因，四環素類的耐藥基因tetB和tetO的攜帶率最高，達到100%；blaCMY、aph(2″)-Ⅰb、tetM和floR基因的攜帶率達到80%～85%；磺胺類耐藥基因sul2和sul3、四環素類tetM基因和氟苯尼考中的floR基因檢出率為60%以上。李海利等[16-17]報道河南省APP對四環素類耐藥基因的最高檢出率為78.8%，磺胺類耐藥基因sul2的檢出率為100%。對比發現本研究對四環素類耐藥基因的檢出率增加，這與前面藥敏試驗結果中對四環素類藥物的耐藥性較高表現一致；值得注意的是有些分離菌株對氟苯尼考不耐藥，但仍然能檢出floR基因。

本試驗結果顯示，耐藥基因檢出結果與耐藥表型基本一致，表明耐藥基因的攜帶是細菌對抗菌藥物產生耐藥的主要原因之一。但大環內酯類和喹諾酮類的耐藥基因均未檢測到，藥敏結果卻顯示部分分離株對克拉霉素和恩諾沙星耐藥，說明可能存在其他未檢出的耐藥基因，或其他尚未發現的耐藥機制。

4 結 論

本研究檢測分析了2019-2021年從廣東省不同豬場分離到的20株APP耐藥譜和耐藥基因的攜帶情況。藥敏結果顯示，分離株對四環素類和磺胺類藥物表現出廣泛耐藥，且為多重耐藥；耐藥基因檢測結果顯示，部分耐藥菌株同時攜帶多種耐藥基因，以tetB、tetO和floR等耐藥基因為主。APP耐藥機制復雜，結合耐藥表型和耐藥基因的檢測，篩選敏感藥物，可減少或避免耐藥菌株的出現，對防治豬傳染性胸膜肺炎有重要的實踐意義。