基于網絡藥理學及分子對接技術研究黃芪調控仔豬腸道菌群失調性腹瀉的作用

孫悅龍，張夢潔，豆佳紅,2，王小瑩，戴小楓，李秀梅

(1.中國農業科學院飼料研究所，農業農村部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

仔豬腹瀉是仔豬生長過程中普遍存在、危害嚴重的一類疾病，輕則減緩仔豬生長發育，重則導致仔豬脫水死亡[1]，給養殖業帶來重大經濟損失。仔豬消化器官不發達，消化酶含量處于較低水平，腸道免疫系統尚未成熟，極易受到病原菌的侵擾和外界環境的影響[2]。已有研究表明，腸道微生物被認為是宿主的“第二基因組”，當仔豬腸道菌群的類型、數量、結構等發生變化，菌群的相關代謝活動發生相應變化，腸道菌群失調，仔豬易發生腹瀉[3]。目前，對于仔豬腹瀉的治療方式仍以抗生素為主，抗生素的長期使用，易產生超級耐藥菌和污染環境，尋求新的藥物治療方式顯得尤為重要。中草藥作為一種綠色、多靶點的藥物，已成為研究熱點。

黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge.)用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、內熱消渴、血虛萎黃、久潰不斂等癥，具有抗氧化、抗炎、免疫調節等作用[4]。尹佳婷等[5]采用小鼠自然衰老模型，驗證了黃芪能增加小鼠腸道微生物多樣性，恢復腸道穩態。張陽等[6]在生長育肥豬基礎飼糧中添加0.1%黃芪多糖顯著降低了豬糞便微生物的多樣性。但鮮有研究報道黃芪對仔豬腸道菌群失調性腹瀉的調節作用，因此，本研究運用網絡藥理學及分子對接技術研究了黃芪用于調控仔豬腸道菌群失調性腹瀉的有效活性成分及其潛在作用機制，以期為黃芪的應用及進一步試驗研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 黃芪主要活性成分及作用靶點的搜集

利用中藥藥理學數據庫TCMSP[7](https:∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)搜集黃芪的活性成分，設置口服吸收利用度(oral bioavailablity，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[8]進行篩選，并通過TCMSP數據庫進一步搜集相關活性成分的靶點，在Uniprot數據庫(https:∥www.uniprot.org/)中進行標準化。利用Cytoscape_3.8.0軟件構建黃芪活性成分-潛在作用靶點網絡圖。

1.2 腸道菌群失調性腹瀉相關靶點及交集靶點的獲取

以“flora imbalance diarrhea”為關鍵詞，于GeneCards(https:∥www.genecards.org/)和OMIM(https:∥omim.org/)數據庫中進行腸道菌群失調性腹瀉疾病靶點搜集并去重后，在Uniprot數據庫中獲取靶點簡稱，設置物種為Susscrofa進行標準化，建立疾病靶點數據集。利用Venny_2.1.0軟件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對黃芪活性成分與腸道菌群失調性腹瀉疾病靶點取交集得到交集靶點，并制作Venn圖。

1.3 黃芪-活性成分-作用靶點-疾病相互作用網絡構建

將1.1中獲得的黃芪活性成分與1.2中獲得的交集靶點導入Cytoscape_3.8.0軟件，構建黃芪-活性成分-作用靶點-腸道菌群失調性腹瀉網絡圖。

1.4 黃芪與腸道菌群失調性腹瀉蛋白-蛋白相互作用網絡構建與拓撲分析

將1.2中獲取的交集靶點導入STRING數據庫(https:∥cn.string-db.org/)，設置物種為Susscrofa，獲得蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡圖，分析交集網絡中節點的屬性值，并導出文件，利用Cytoscape_3.8.0軟件進行拓撲分析。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析

將1.2中獲得的交集靶點導入DAVID數據庫(https:∥david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，設置物種為Susscrofa，進行GO功能和KEGG通路富集分析，獲得黃芪調控仔豬菌群失調性腹瀉的潛在通路。

1.6 分子對接驗證

選取PPI網絡中前10個關鍵靶點和對應的黃芪活性成分進行分子對接。利用PubChem數據庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載黃芪活性成分化合物2D文件，導入Chem3D_20.0.0.41中以最小能量進行3D轉換并保存為mol2格式文件，經AutoDuckTools_1.5.7轉化為pdbqt格式文件。利用PDB數據庫(https:∥www.rcsb.org/)下載關鍵靶點的三維晶體結構，經Pymol軟件去除水分子和配體，導入至AutoDuckTools_1.5.7進行加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為pdbqt格式文件。將上述兩部分經AutoDuck_4.2.6進行分子對接，對接結果經Pymol_2.4.0可視化。

2 結 果

2.1 黃芪主要活性成分及作用靶點

基于TCMSP數據庫共獲得87個活性成分，以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選出20個活性成分。將活性成分作用靶點經Uniprot數據庫中已認證的豬基因進行標準化，得到11個活性成分(表1)，對應119個作用靶點，去重后得到65個潛在靶點。

表1 黃芪主要活性成分

將黃芪11個主要活性成分及作用靶點導入Cytoscape_3.8.0軟件進行映射，構建黃芪主要活性成分-藥物靶點網絡可視化；得到77個節點(節點表示黃芪活性成分和藥物靶點)和130條邊(邊表示黃芪活性成分和靶點之間的相互作用)(圖1)。

正方形代表中藥；六邊形代表黃芪的有效成分；菱形代表黃芪作用靶點Square represents traditional Chinese medicine；Hexagon represents effective components of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.；Diamond represents targets of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.圖1 黃芪主要活性成分-靶點網絡圖Fig.1 Active ingredients-target network of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.

2.2 菌群失調性腹瀉相關靶點及交集靶點

經GeneCards和OMIM數據庫檢索，分別得到菌群失調性腹瀉靶點258、873個，去除重復項后共計854個靶點，將其與2.1得到的藥物靶點經Venny_2.1.0軟件取交集得到靶點25個(圖2)，分別為半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、C-C基序趨化因子2(CCL2)、C-反應蛋白(CRP)、重組白細胞介素-8(CXCL8)、雌激素受體(ESR1)、雌激素β受體(ESR2)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、熱休克蛋白β-1(HSPB1)、γ干擾素(IFNG)、白細胞介素-10(IL10)、IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6、干擾素調控因子1(IRF1)、轉錄因子AP-1(JUN)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、NF-κB抑制劑α(NFKBIA)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、Mu型阿片受體(OPRM1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、抗白細胞蛋白酶(SLPI)、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)。

圖2 黃芪與菌群失調性腹瀉交集靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.and flora imbalance diarrhea

2.3 黃芪-活性成分-作用靶點-疾病相互作用網絡構建

整合黃芪、活性成分、菌群失調性腹瀉靶點，導入Cytoscape_3.8.0軟件構建黃芪-活性成分-作用靶點-菌群失調性腹瀉網絡圖，結果見圖3。

圓形代表疾病；正方形代表中藥；六邊形代表中藥的有效成分；菱形代表黃芪作用靶點Circle represents disease；Square represents traditional Chinese medicine；Hexagon represents active ingredient of traditional Chinese medicine；Diamond represents target of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.圖3 黃芪-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖Fig.3 Network model of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.-chemical components-target-disease

由圖3可知，試驗得到36個節點和105條邊，25個交集靶點對應黃芪9個活性成分，分別為槲皮素(MOL000098)、華良姜素(MOL000239)、異鼠李素(MOL000354)、美迪紫檀素(MOL000371)、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇(MOL000378)、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基-6a,11a-二氫-6H-苯并吡喃[3,2-c]-3-醇(MOL000380)、芒柄花素(MOL000392)、毛蕊異黃酮(MOL000417)、山奈酚(MOL000422)。不同活性成分平均作用6.3個靶點，其中，槲皮素作用于20個靶點，山奈酚作用于8個靶點，芒柄花素作用于7個靶點；不同疾病靶點平均對應3.84個活性成分，體現了中草藥多成分與多靶點共同作用的整體性。

2.4 黃芪與菌群失調性腹瀉PPI網絡構建

將獲取的25個交集靶點導入STRING數據庫，設置物種為Susscrofa，選擇置信度≥0.04，去除游離蛋白，獲得23個靶點的PPI網絡圖。由圖4可知，共有23個蛋白節點和680條邊，平均節點度為29.6。各靶點間具有良好的蛋白交互作用，其中JUN和TNF靶點度值最高，為42，其次是IL6和CASP3，度值為40。

圖4 交集靶點PPI網絡圖Fig.4 PPI network of the common targets

根據節點度值繪制所有靶點蛋白的柱形圖。由圖5可知，黃芪與菌群失調性腹瀉靶點中的JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2和PPARG等有較大互作頻率，說明黃芪可能通過以上靶點調控仔豬腸道菌群失調性腹瀉，這些靶點在黃芪調控仔豬腸道菌群失調性腹瀉的作用機制中可能發揮重要作用。

圖5 交集靶點度值Fig.5 Degree of the common targets

將蛋白互作分析結果導入Cytoscape_3.8.0軟件繪制交互網絡圖，進行拓撲分析。由圖6可知，JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2和PPARG間具有較好的PPI，其中IL1B和IL1A的互作評分為0.991，TNF和JUN的互作評分為0.985，IL6和JUN的互作評分為0.978。表明黃芪可能通過TNF、JUN、IL1B、IL6等靶點調控仔豬腸道菌群失調性腹瀉。

圖6 交集靶點相互作用網絡圖Fig.6 Network model of common targets

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

為進一步探討黃芪治療菌群失調性腹瀉的作用機制，將交集靶點導入DAVID數據庫，得到GO功能富集條目94條，其中生物過程(biological process，BP)74條，細胞組分(cellular component，CC)6條，分子功能(molecular function,MF)14條；KEGG通路61條。

選取排名前10的GO功能富集條目繪圖，結果見圖7。由圖7可知，生物過程主要包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、免疫反應(immune response)、序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正調控(positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity)、轉錄正調控，DNA模板(positive regulation of transcription,DNA-templated)等；細胞組分包括胞外間隙(extracellular space)、細胞核(nucleus)、核染色質(nuclear chromatin)、質膜外側面(external side of plasma membrane)等；分子功能主要包括細胞因子活性(cytokine activity)、轉錄因子活性,序列特異性DNA結合(transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、DNA結合(DNA binding)、相同蛋白結合(identical protein binding)等。

圖7 GO功能富集分析柱形圖Fig.7 Column chart of GO function enrichment analysis

選取排名前20的KEGG富集通路繪圖，結果見圖8。由圖8可知，黃芪調控菌群失調性腹瀉的靶點主要涉及以下KEGG通路：美國錐蟲病(American trypanosomiasis)、百日咳(pertussis)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、利什曼病(leishmaniasis)等。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

由圖3可知，黃芪調控仔豬菌群失調性腹瀉的主要活性成分為槲皮素、山奈酚和芒柄花素。由圖4可知，槲皮素、山奈酚、芒柄花素作用的靶點主要為TNF、JUN、CASP3、IL6、NFKBIA、IL1B、IL10、TP53、PPARG和CCL2。基于此，將上述靶點分別與其相對應的黃芪活性成分進行分子對接，并計算最低結合能，結果見表2。結合能<0表示2個分子能自發結合，結合能越小，分子結合能力越強，構象越穩定。由表2可知，上述10個靶點與黃芪活性成分表現出不同的結合能力，其中，結合能最低的是芒柄花素與PPARG靶點的結合，結合能為-6.19 kJ/moL，其次是槲皮素與IL1B靶點的結合，結合能為-5.37 kJ/moL，槲皮素與TNF靶點的結合能為-5.10 kJ/moL，山奈酚和TNF靶點的結合能為-5.30 kJ/moL。

表2 黃芪主要活性成分與蛋白最低結合能

由圖9可知，芒柄花素結合到PPARG，與異亮氨酸(Ile)-281殘基形成氫鍵相互作用，鍵長2.2；槲皮素結合到IL1B，與天冬酰胺(Asn)-99、色氨酸(Trp)-98、天冬氨酸(Asp)-63殘基形成氫鍵相互作用，平均鍵長2.16；槲皮素結合到TNF，與甘氨酸(Gly)-142、亮氨酸(Leu)-145、蘇氨酸(Thr)-138殘基形成氫鍵相互作用，平均鍵長2.3；山奈酚結合到TNF，與半胱氨酸(Cys)-150、苯丙氨酸(Phe)-143、甘氨酸(Gly)-142、蘇氨酸(Thr)-138、亮氨酸(Leu)-145和半胱氨酸(Cys)-139殘基形成氫鍵相互作用，平均鍵長2.4。

A,疾病靶點；B,氫鍵；C,黃芪主要活性成分A，Disease target；B,Hydrogen bond；C,Main active ingredients圖9 關鍵靶點與活性成分的分子對接Fig.9 Molecular docking of important targets and active ingredients

3 討 論

研究表明，腸道菌群在保護宿主健康中發揮著重要作用。仔豬在受到外界環境、抗生素藥物等影響下，腸道菌群失調，正常菌群豐度減少，條件致病菌等病原微生物豐度得到提高，誘發機體產生免疫應答反應[9]。腹瀉是腸道菌群失調的臨床表現之一，一旦仔豬發生腹瀉，若沒有得到及時救治，極易導致大量仔豬脫水死亡[10]。

本研究通過網絡藥理學構建了“黃芪-活性成分-潛在靶點”和“黃芪-活性成分-靶點-疾病”網絡圖，最終篩選到9個主要活性成分，主要為槲皮素、華良姜素、異鼠李素、美迪紫檀素、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、芒柄花素、毛蕊異黃酮和山奈酚等，對應25個交集靶點。

PPI結果顯示，黃芪與菌群失調性腹瀉靶點中的JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2、PPARG等有較大互作頻率。前10個靶點所對應的黃芪活性成分主要為槲皮素、山奈酚、芒柄花素。槲皮素是一種天然的黃酮類物質，存在于各種植物的花、葉、果實等之中，具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、調節腸道微生物多樣性等生物活性，且具有較高的食用安全性[11]。研究表明，槲皮素能提高腸道中擬桿菌門的豐度，降低變形桿菌的豐度，具有良好的調節機體菌群平衡的能力[12]。陳櫻萌等[13]通過光電比濁法觀測槲皮素對小鼠腸道菌群失調的調節作用，結果顯示，槲皮素對腸球菌表現為強烈抑制作用，對乳桿菌表現為一定程度的促生長作用。山奈酚是一種天然的黃酮醇類物質，存在于水果、蔬菜及藥食同源植物中，具有保護神經、抗腦血管疾病、防治代謝型疾病、緩解腸道炎癥等作用[14-15]。曲一帆[16]研究表明，山奈酚能增加結腸長度，調節結腸中炎性轉錄因子的轉錄，上調緊密連接蛋白表達，并進一步通過提高厚壁菌門與擬桿菌門的比例，降低變形桿菌等致病菌相對豐度，增加腸道菌群多樣性和豐富度。芒柄花素是廣泛存在于紅三葉草、黃芪等中的黃酮類物質，具有較強的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[17]。盡管芒柄花素被證實能有效抑制腫瘤細胞的轉移擴散[18]和改善腸道屏障[19]，但沒有直接證據表明芒柄花素能夠調整腸道微生物多樣性。

在黃芪調控菌群失調性腹瀉關鍵靶點中，JUN是DNA結合蛋白，是轉錄因子AP-1的組成部分，轉錄因子AP-1的活性收到絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調控。當機體腸道受到病原微生物侵染后，腸道上皮細胞MAPK通路被激活，從而誘導轉錄因子AP-1的DNA結合活性，進而產生IL-8[20]。TNF、IL6、IL1B、IL10等與炎癥有關，可能是黃芪免疫調節的核心靶點[21]，當機體受到病原微生物侵染發生炎癥反應時，其水平升高并激活相關信號通路，調節巨噬細胞等非特異性免疫，還可進一步激活特異性免疫釋放炎癥因子[22]。CASP3在細胞凋亡中起到重要作用，研究表明，細胞凋亡過程實際為Caspase被激活進而發生凋亡蛋白酶的級聯反應，當宿主發生氧化應激后，凋亡誘導因子自線粒體釋放至胞漿中，激活CASP3，誘導細胞凋亡[23-24]。NFKBIA通過屏蔽NF-κB蛋白的核定位信號將其隔離在細胞質中抑制NF-κB信號通路，NF-κB信號通路的激活可調節一系列與炎癥和免疫相關的基因表達[25]。TP53是蛋白質和基因組的保護者，在防止基因組突變中起著保持穩定的作用，此外，TP53在控制氧化應激、DNA損傷、調控核糖體功能障礙和缺氧等方面發揮免疫作用[26]。CCL2又稱單核細胞趨化蛋白-1(MAP-1)，是首個發現的人類CC趨化因子家族成員，研究發現，大多數趨化因子都能作為促炎因子參與感染、炎癥等機體生理和病理過程，目前，趨化因子已被確定為多種疾病的潛在治療靶點[27]。PPARG參與多種代謝途徑，通過控制脂肪酸的過氧化物酶體β-氧化途徑，調節脂肪細胞分化和葡萄糖穩態，還可介導腸道脂質代謝，影響腸道中脂質生成、脂質吸收和脂質轉運[28]。

GO功能富集分析顯示，黃芪治療菌群失調性腹瀉的過程主要富集在轉錄調控、免疫反應、細胞對脂多糖的反應等。KEGG通路富集結果表明，黃芪治療仔豬菌群失調性腹瀉主要與美國錐蟲病、炎癥性腸病、阿米巴病、細胞因子-細胞因子受體相互作用、A型流感、瘧疾、T細胞受體信號通路、沙門菌感染等信號通路密切相關。通過對KEGG代謝通路的富集分析發現，造成仔豬腹瀉的可能原因主要為病原微生物入侵后誘發的炎癥反應。同時，本研究發現，在多個信號通路中存在交集靶點，如黃芪可通過調控IL10、NFKBIA、JUN、IL6、CCL2、TNF等靶點對美國錐蟲病發揮作用，還可通過調控IL10、JUN、IL6、TNF等靶點對炎癥性腸病發揮作用等，進一步說明了黃芪在仔豬菌群失調性腹瀉方面并非通過一個靶點進行治療的，而是通過多靶點進行疾病治療[29]。

黃芪主要活性成分與靶點分子對接結果顯示，槲皮素與TNF、IL1B具有良好的結合活性，山奈酚與TNF具有良好的結合活性，芒柄花素與PPARG具有良好的結合活性。研究表明，腸道中革蘭氏陰性菌產生的脂多糖作為炎癥觸發因子激活 NF-κB 信號通路，促進炎性因子 TNF-α、IL6、IL1B的合成和釋放，從而導致腸道組織產生炎癥[30]；槲皮素、山奈酚可通過調節腸道菌群和增強腸道屏障功能，減少脂多糖的產生，減少腸道炎癥反應[31]；此外，槲皮素能通過降低TNF-α、IL6和IL1B的表達水平，進而抑制腸道炎癥反應[32]。這與GO功能和KEGG通路富集分析結果相一致，即黃芪通過調節細胞對脂多糖的反應或增強腸道屏障，減少病原微生物入侵治療仔豬菌群失調性腹瀉。已有研究證明，芒柄花素參與多種炎癥反應，可降低炎性因子的表達水平[33]，本研究中芒柄花素與PPARG具有較好的結合能力，這還有待于進一步分析。同時，本研究再次證明了中草藥在治療疾病時是由多個活性組分發揮作用的。

4 結 論

本研究結果表明，黃芪調控仔豬菌群失調性腹瀉的主要活性成分可能為槲皮素、華良姜素、異鼠李素、芒柄花素、毛蕊異黃酮、山奈酚等，涉及的核心靶點主要有JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2、PPARG，黃芪調控仔豬菌群失調性腹瀉的可能通路主要為美國錐蟲病、炎癥性腸病、阿米巴病、細胞因子-細胞因子受體相互作用、A型流感、瘧疾、T細胞受體信號通路、沙門菌感染等，為黃芪后期的研究和開發提供了參考依據。