牦牛源BVDV非結構蛋白NS5A的原核表達及抗原表位分析

王慧慧，馮茜莉，蒲飛洋，李易聰，汪夢竹，周小凱，趙澤陽，馬忠仁，李 倬，馬曉霞

(1.西北民族大學生物醫學研究中心，蘭州 730030;2.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730010)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea,BVD)及黏膜病(mucosal disease,MD)的主要病原，也稱牛病毒性腹瀉-黏膜病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal diseas virus,BVD-MDV)，畜群感染該病毒后臨床癥狀復雜多樣，可表現為腹瀉、血小板減少、急性或慢性黏膜疾病、免疫抑制、出血綜合征和持續性感染，并出現繁殖障礙，即母畜流產、產死胎和畸形胎等，也可由免疫抑制導致呼吸系統、消化系統性疾病[1-2]，給全世界范圍內的養殖業造成嚴重的經濟損失。BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)及邊界病毒(Border disease virus,BDV)也屬于瘟病毒屬，它們之間有較高的相似性，且能突破宿主特異性，存在交叉抗原并且多克隆抗體對BVDV和CSFV具有血清學交叉反應[3-4]。BVDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，僅有一種血清型，不同毒株間存在遺傳多樣性，即存在大量基因亞型[5-8]。根據病毒基因組5′-非翻譯區(5′-untranslated region，5′-UTR)序列的差異性，可將病毒分為BVDV-1和BVDV-2兩個基因型，并且根據病毒液接種細胞后能否產生細胞病變，可把BVDV毒株分為非致細胞病變型(non-cytopathogenic,NCP)和致細胞病變型(cytopathogenic,CP)兩種生物型[9-10]。

BVDV基因組全長大約12.5 kb，整個基因組由5′-UTR、開放閱讀框 (open reading frame,ORF)和3′-UTR組成。ORF編碼區編碼一條長約4 000個氨基酸的多聚蛋白前體多肽鏈，并進一步由細胞和病毒基因編碼的蛋白酶加工成成熟的病毒蛋白，包括4個結構蛋白和8個非結構蛋白[11]。這些蛋白在基因組上的位置從N端到C端依次為：Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。其中Capsid、Erns、E1和E2為BVDV的結構蛋白，構成BVDV的衣殼和囊膜，其余8種為非結構蛋白[12]。這些非結構蛋白在病毒的復制、轉錄及病毒與宿主的相互作用中起重要作用。其中非結構蛋白NS5A由497個氨基酸殘基構成，其編碼基因長約1 488 bp，是一種磷酸化酶，可以與多種宿主細胞蛋白作用，同時也是病毒復制子的重要組成部分[13]。此外，NS5A還可以結合病毒5′-UTR，并與3′-UTR互作誘發氧化應激，從而調節病毒基因組的復制[14]。由于對NS5A蛋白的表達功能研究較少，因此本研究利用原核表達系統體外表達NS5A基因，獲得非結構蛋白NS5A，為后續病毒與宿主細胞蛋白互作篩選及病毒的免疫學檢測奠定基礎。利用原核表達系統表達周期短、水平高的特點構建BVDV NS5A原核表達載體，進行原核表達，并對表達蛋白進行鑒定，為進一步研究BVDV非結構蛋白NS5A的生物學功能奠定基礎。通過DNAStar預測NS5A蛋白抗原表位，為疫苗和藥物研發及BVDV防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及毒株 牛腎細胞(Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK)和BVDV毒株GSTZ由生物工程與技術國家民委重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑和質粒小提試劑盒均購自Invitrogen公司；瓊脂糖、DNA回收試劑盒、50×TAE、PVDF膜均購自Solarbio公司；4×Lodding Buffer、DNA Marker、限制性核酸內切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ、IPTG、氨芐青霉素、T4 DNA連接酶、pET-28a(+)載體、TaqDNA聚合酶、RNA反轉錄試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；新生牛血清(NBS)、DMEM培養基、胰酶均購自蘭州民海生物工程有限公司；鼠抗His多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG購自北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均由生物工程與技術國家民委重點實驗室提供。

1.1.3 主要儀器 核酸電泳儀(BIO-RAD)購自北京市六一儀器廠；超聲細胞破碎儀(SC2ENT2-650-E)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；化學發光分析儀(WD-9423C)購自北京六一生物科技有限公司；臺式搖床(KB3-D)購自杭州瑞城儀器有限公司；CO2培養箱(3111)購自賽默飛世爾科技公司；酶標儀(1530)、梯度PCR儀(K960)購自力新儀器(上海)有限公司；水浴鍋(HH-1)購自北京科偉永興儀器有限公司；超低溫冰柜(DW-86L386)購自海爾集團。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 將從牦牛血清中分離到的BVDV GSTZ毒株接種到MDBK細胞中進行增殖，每隔24 h觀察1次，發現細胞病變，即細胞脫落變圓、聚集成堆、細胞瓶上出現空泡變性時收取細胞，同時設不接毒的細胞為陰性對照，于-80 ℃反復凍融3次，根據Trizol法提取RNA的說明書提取病毒RNA，于-80 ℃保存備用。

1.2.2 引物的設計與合成 根據GenBank中公布的BVDV-1型毒株V006的NS5A基因核苷酸序列(GenBank登錄號：KX170647)，利用Primer Premier 5.0軟件設計1對特異性檢測引物(BVDV NS5A-F:5′-CCCAAGCTTATGTCTGGGAA-3′，BVDV NS5A-R:5′-TATACAATGAAGCTAGGATCCGCG-3′)擴增NS5A基因,預期擴增片段大小為1 488 bp，下劃線部分分別為Hind Ⅲ和BamHⅠ的酶切位點。引物由金唯智生物有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增BVDVNS5A基因 利用反轉錄試劑盒將提取的病毒總RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板擴增NS5A基因，反應體系參照反轉錄試劑盒說明書。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環；72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，用膠回收試劑盒回收目的片段，于-20 ℃保存備用。部分產物送西安擎科生物技術有限公司測序，用于遺傳進化分析。

1.2.4NS5A基因遺傳進化分析 從GenBank中找出17株BVDVNS5A基因序列，分別為：C24V株(GenBank登錄號：AF091605)、VEDEVAC株(GenBank登錄號：AF268278)、C413株(GenBank登錄號：AF002227)、KS86-1cp株(GenBank登錄號：AB078952)、KS86-1ncp株(GenBank登錄號：AB078950)、Osloss株(GenBank登錄號：M96687)、p24515株(GenBank登錄號：AY149216)、SD-1株(GenBank登錄號：M96751)、New York 93株(GenBank登錄號：AF502399)、ZM-95株(GenBank登錄號：AF526381)、Singer_Arg株(GenBank登錄號：DQ088995)、KE9株(GenBank登錄號：EF101530)、p11Q株(GenBank登錄號：AY149215)、XJ-04株(GenBank登錄號：FJ527854)、JZ05-1株(GenBank登錄號：GQ888686)、Hokudai-Lab/09株(GenBank登錄號：AB567658)和CP7株(GenBank登錄號：U63479)。應用DNAStar中Clustal W Method和Mega 5.0軟件對上述病毒株NS5A基因的核苷酸序列進行比對，繪制遺傳進化樹并分析[15-16]。

1.2.5 原核表達載體的構建 將NS5A基因和載體pET-28a(+)分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收酶切產物后進行連接，連接體系10 μL：NS5A酶切產物7 μL，pET-28a(+)酶切產物1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，Buffer 1 μL。16 ℃過夜連接。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌落進行質粒提取，經BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鑒定正確后，將重組質粒送金唯智生物技術有限公司測序，經測序正確的質粒命名為pET28a-NS5A。然后將鑒定正確的重組質粒pET28a-NS5A轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂板后挑取單個菌落，于37 ℃培養擴增后進行質粒提取并用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，將陽性克隆送金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.6 NS5A原核表達及檢測 挑取已鑒定的陽性菌落加入到含有50 μg/mL氨芐青霉素的10 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min震蕩過夜培養，取新鮮菌液按1∶100加至含有氨芐青霉素的LB培養基中，200 r/min震蕩培養，在600 nm 吸光度達到0.6～0.8時，加入1 mol/L IPTG，分別誘導3、6、9和12 h，同時設未誘導空載體和未誘導表達載體為對照組，收集2 mL菌液，將收集的菌體4 ℃、12 000 r/min 離心 5 min，棄上清，向沉淀中加入100 μL PBS緩沖液混勻，加入25 μL 4×Loadding Buffer，100 ℃金屬浴煮10 min，冷卻后取10 μL蛋白樣品進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并進行考馬斯亮藍染色。另外重組蛋白經10% SDS-PAGE分析后，用濕轉轉印儀將蛋白從凝膠轉移到PVDF膜上，用10 mL 50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次20 min。然后用一抗鼠抗His多克隆抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次20 min。二抗HRP標記的山羊抗小鼠的IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。HRP顯色分析。

1.2.7 BVDV NS5A蛋白抗原表位的預測 利用DNAStar軟件提供的protean模塊中的Kyte-Doolittle、Emini、Karplus-Schulz、以及Garnier-Robson和Chou-Fasman方法對NS5A蛋白親水性、表面可塑性、蛋白柔性以及蛋白的二級結構進行預測；然后利用Jameson-Wolf法預測NS5A蛋白抗原性，并綜合蛋白質的親水性、表面可塑性、蛋白柔性以及二級結構分析NS5A蛋白抗原表位[17-18]。

2 結 果

2.1 GSTZ毒株感染細胞結果

將BVDV GSTZ毒株懸液接種到MDBK細胞中進行增殖，每隔24 h觀察1次，48 h時發現細胞出現病變，細胞脫落變圓、聚集成堆，72 h時細胞出現空泡變性，陰性對照則無明顯變化(圖1)，此時收取細胞。

2.2 BVDV NS5A基因PCR擴增結果

BVDVNS5A基因PCR擴增獲得了1條1 488 bp的特異性目的條帶(圖2)，與預期一致。

M，DL5000 DNA Marker；1，NS5A基因；2，陰性對照M，DL5000 DNA Marker；1，NS5A gene;2，Negative control圖2 NS5A基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of NS5A gene

2.3 NS5A基因遺傳進化分析

遺傳進化樹結果顯示，GSTZ毒株NS5A序列與BVDV-1型毒株Singer Arg株和NS3株的進化關系較近(圖3)；與BVDV-2型的病變型New York 93株、Hokudai-Lab/09、XJ-04、JZ05-1以及非病變型P4515株、C413株被劃分于不同的進化分支上。由此可以推斷出GSTZ毒株基因型屬于BVDV-1型。

圖3 BVDV NS5A基因的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of BVDV NS5A gene

2.4 原核表達載體的構建

隨機挑取6個單克隆菌落進行質粒提取，經BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定，分別在1 488 bp和5 369 bp處出現單一條帶(圖4)，表明目標序列與pET-28a(+)表達載體連接成功。測序結果表明，NS5A基因片段正確插入原核表達載體pET-28a(+)中，所構建的原核重組質粒pET28a-NS5A可用于后續相關試驗。

M，DL2000 DNA Marker；1～6，pET28a-NS5A雙酶切M，DL2000 DNA Marker；1-6，Double digestion of pET28a-NS5A圖4 質粒pET28a-NS5A酶切鑒定Fig.4 Identification of plasmid PET28A-NS5A by enzyme digestion

2.5 pET28a-NS5A誘導表達及Western blotting檢測NS5A蛋白的表達

由SDS-PAGE電泳結果可知，與未誘導的pET28a-NS5A重組菌相比，IPTG誘導的pET28a-NS5A重組菌在55 ku處出現目的條帶(圖5)。為進一步探究NS5A是否在大腸桿菌中有效表達，經Western blotting檢測重組蛋白被抗His抗體特異性識別(圖6)，大小與預期相同，而空載體組并沒有出現明顯條帶。表明NS5A在大腸桿菌中得到了表達。

M，蛋白質分子質量標準；1，未誘導的pET-28a(+)；2，未誘導的pET28a-NS5A；3，IPTG誘導9 h后的pET-28a(+)；4～7，IPTG分別誘導3、6、9、12 h后的pET28a-NS5AM，Protein Marker;1，pET-28a(+) uninduced;2，pET28a-NS5A uninduced;3，pET-28a(+) induced by IPTG for 9 h;4-7,pET28a-NS5A induced by IPTG for 3,6,9 and 12 h,respectively圖5 pET28a-NS5A重組質粒的誘導表達Fig.5 Prokaryotic expression of recombinant pET28a-NS5A plasmid

圖6 Western blotting 檢測NS5A蛋白Fig.6 Detection of NS5A protein by Western blotting

2.6 NS5A蛋白抗原表位預測

2.6.1 NS5A蛋白親水性及表面可塑性的預測 蛋白親水性預測結果表明，NS5A蛋白具有較高的親水性，主要集中在12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463和469—495位氨基酸處(圖7)。表面可塑性分析結果顯示，NS5A蛋白表面可塑性較高的區域主要為14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸處(圖8)。

圖7 Kyte-Doolittle 預測 NS5A蛋白的親水性Fig.7 Hydrolicity of NS5A protein predicted by Kyte-Doolittle

圖8 Emini預測NS5A蛋白的表面可塑性Fig.8 Surface accessibility of NS5A protein predicted by Emini

2.6.2 NS5A蛋白柔性區域預測 Karplus-Schulz法預測NS5A蛋白柔性區域，結果顯示NS5A蛋白上含有的柔性區域較多，主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸處(圖9)。

圖9 Karplus-Schulz 預測NS5A蛋白柔性區域Fig.9 Flexible regions of NS5A protein predicted by Karplus-Schulz

2.6.3 NS5A蛋白二級結構的預測 使用Garnier-Robson和Chou-Fasman 2種方法對BVDV NS5A蛋白的二級結構進行分析，發現不同的預測方法對蛋白二級結構的分析存在差異，并且α-螺旋、β-折疊、轉角和無規則卷曲特定結構的數目及所處的位置也存在明顯差異(圖10)。2種方法共有的α-螺旋區域主要集中在105—108、114—118、144—148、173—184、188—194、328—334、372—383、386—413、425—436、448—456和468—478位氨基酸處；共有的β-折疊區域主要集中在5—11、42—43、96—99、112—115、118—129、152—155、157—161、199—209、211—216、229—241、286—296、323—327、339—344、419—424和492—496位氨基酸處；共有的轉角區域主要在32—35、37—40、46—50、58—60、88—90、131—135、195—198、301—303、335—337、364—366和440—411位氨基酸處；而Garnier-Robson預測的無規則卷曲位于28—30、69—73、165—171、248—150、304—306、317—322、345—351、366—368和443—447位氨基酸處。

A，α-螺旋；B，β-折疊；T，轉角；C，無規則卷曲A，Alpha helix；B，Beta sheet；T，Turn；C，Random coil圖10 Garnier-Robson和Chou-Fasman預測NS5A蛋白的二級結構Fig.10 Secondary structure of NS5A protein predicted by Garnier-Robson and Chou-Fasman

2.6.4 NS5A蛋白抗原性預測 NS5A蛋白所在的抗原性區域主要位于15—23、33—114、129—138、141—146、153—160、167—190、193—202、216—228、241—263、270—277、294—341、346—362、364—380、414—424和465—493位氨基酸處(圖11)。

圖11 Jameson-Wolf 預測 NS5A蛋白的抗原性Fig.11 Antigenicity of NS5A protein predicted by Jameson-Wolf

綜合以上預測和分析，并結合NS5A蛋白的二級結構特點，得出NS5A蛋白存在B細胞優勢抗原表位，主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸殘基處(表1)。

表1 氨基酸位點

3 討 論

NS5A蛋白的具體功能雖然尚不明確，但是NS5A復雜多樣的功能使其成為抗病毒藥物研發的靶標。NS5A蛋白通過和NS3、NS4A、NS4B及NS5B蛋白形成病毒的復制酶復合體，參與病毒基因的復制[19]。其他研究還發現，NS5A蛋白和NS4B蛋白可以和細胞內的囊泡膜結合蛋白A結合[20]。NS5A蛋白在BVDV的生活周期中所扮演的具體角色還沒有定論，除了參與病毒基因復制之外，NS5A蛋白對BVDV的蛋白翻譯也具有調節作用[21-22]。目前，BVDV疫情在全世界范圍內以不同的程度暴發，給養殖業帶來嚴重的威脅，在BVDV基因組5′-UTR內存在著一段特殊的序列，稱為核糖體內部進入位點(internal ribosome entry site，IRES)，這段序列可以通過和核糖體結合而促進BVDV的蛋白翻譯[23]。BVDV NS5A蛋白可以和5′-UTR的IRES結合，從而中斷核糖體與IERS的結合，抑制BVDV的蛋白翻譯而影響起始病毒的基因復制，使病毒從蛋白的合成階段進入到病毒基因的復制階段，這種作用在病毒感染早期具有重要意義。

NS5A蛋白相較于BVDV其他蛋白來說較保守，Fu等[24]的研究表明，BVDV NS5A與翻譯延伸因子1α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)的互作關系較為保守，這也可在一定程度上影響BVDV復制。本研究用RT-PCR的方法獲得BVDV非結構蛋白NS5A基因，然后將其克隆到原核表達載體pET-28a(+)中，通過酶切和序列測定證實重組質粒構建正確，并利用大腸桿菌誘導表達，通過電泳檢測和Western blotting證明非結構蛋白NS5A在大腸桿菌內得到表達。NS5A原核表達載體的成功構建為后期NS5A蛋白功能和致病性機制的研究創造了條件，可以通過NS5A蛋白功能特點及與其他蛋白的互作關系研制抑制病毒復制的相關藥物，如黃雯靜[25]通過生物信息學軟件預測了甲基轉移酶3 (methyltransferase-like 3，METTL3)與BVDV NS5A蛋白可能的相互作用關系，為抑制病毒復制奠定基礎。本研究也根據DNAStar軟件預測分析了NS5A蛋白的二級結構，了解該蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉角及無規則卷曲等區域的結構分布信息，并從蛋白的親水性、表面可塑性、柔性和抗原性等方面對NS5A蛋白的抗原表位分布和構成情況進行了全面分析，為深入研究該蛋白的免疫學特性及研發BVDV新型疫苗和藥物靶標奠定基礎。

4 結 論

本研究成功表達并鑒定了牦牛源BVDV的非結構蛋白NS5A，系統發育進化樹表明BVDV GSTZ株基因型屬于BVDV-1型，NS5A蛋白的B細胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸處。