豬IFN-δ5的表達純化及其抗PEDV感染的作用分析

宋詩瑩，郭瑋璐，夏學峰，張 雪，畢振威，張雪寒，范寶超，董海龍，李 彬

(1.西藏農(nóng)牧學院動物科學學院，林芝 860000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，南京 210014)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種以腹瀉、嘔吐、脫水為主要臨床癥狀的病毒性疾病，對全世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴重威脅[1-2]。PEDV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb，屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，其可感染所有年齡段仔豬，對新生仔豬危害最大[3]。2010年，中國南方暴發(fā)嚴重PED疫情，造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]，經(jīng)病原學研究證實造成該疫情的元兇為PEDV變異株，與經(jīng)典毒株相比，PEDV變異株致病性更強，可造成新生仔豬100%死亡[5-6]。目前雖已有商品化疫苗，但其效果并不理想，因此，研究有效的預(yù)防和抵抗PEDV變異株感染方法具有重要意義。

干擾素(interferons，IFNs)是抵御病毒感染的第一道防線，在抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用。在抗病毒免疫應(yīng)答中，IFNs的主要功能是誘導抗病毒蛋白的表達，并進一步激活抗病毒反應(yīng)。通常，根據(jù)細胞表面受體結(jié)構(gòu)的不同可將IFNs分為3個亞型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型IFNs包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ和IFN-ζ，在抗病毒免疫反應(yīng)中起直接作用[7]；Ⅱ型IFN，即IFN-γ，由T淋巴細胞和自然殺傷細胞識別感染細胞而產(chǎn)生[8]；Ⅲ型IFNs包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，通過類似于Ⅰ型IFNs的獨特受體復(fù)合物調(diào)節(jié)抗病毒免疫應(yīng)答[9-10]。

針對PEDV的感染，目前研究主要集中于IFN-α和IFN-λ上，且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，豬IFN-λ比IFN-α更能有效減少PEDV在腸上皮細胞中的感染，這可能與IFN-λ主要作用于黏膜上皮，在胃腸道黏膜感染中起關(guān)鍵作用有關(guān)[11-13]。而作為Ⅰ型IFNs的成員之一，IFN-δs于1993年由Lefevre等[14]首次發(fā)現(xiàn)，直到近年來Cochet等[15]通過基因組數(shù)據(jù)庫篩選報道了數(shù)個IFN-δs不同亞型的相關(guān)序列，表明IFN-δs存在于眾多偶蹄動物中，并在基因組中形成一個明顯的簇。豬IFN-δs(pIFN-δs)共有11個功能基因，對豬不同組織中的IFN類型進行測定發(fā)現(xiàn)，pIFN-δs在豬腸道中大量表達[16]，但對其抗豬腸道病毒感染尤其抗PEDV感染的效果尚不清楚。試驗前期研究中對PEDV感染后仔豬腸道進行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)相較于其他IFN亞型，pIFN-δ5呈顯著上調(diào)趨勢。鑒于此，試驗采用原核表達系統(tǒng)表達純化了pIFN-δ5，并對其抗PEDV感染的效果進行了探究，以期為新抗PEDV藥物的研發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)、Vero細胞、IPEC-J2細胞、牛胚胎腎細胞-MDBK、PEDV AH2012/12株、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)及PEDV-N蛋白鼠單克隆抗體均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購自TaKaRa公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectimine 3000、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ均購自Thermo Fisher公司；FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、Phanta Max Master Mix、HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和ChamQ SYBR qPCR Master Mix均購自Vazyme公司；His標簽鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG(H+L)、BCA蛋白定量試劑盒及DAPI染料均購自碧云天生物技術(shù)公司；β-actin兔多克隆抗體、FITC標記山羊抗鼠IgG(H+L)均購自Proteintech公司；His純化層析柱PurKine His-Tag Ni-NTA Packed Column購自武漢艾美捷科技有限公司；PD SpinTrap G-25脫鹽柱購自Cytiva公司。其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 pIFN-δ5的擴增及其重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

采用重組連接的方法獲得包含pIFN-δ5的重組表達質(zhì)粒。根據(jù)GenBank中pIFN-δ5基因序列(登錄號：NM_001164854.1)設(shè)計重組引物：IFN-δ5-F：5′-GCGATATCCAATTCTCTGGGATCCA-TAGGTR-3′；IFN-δ5-R：5′-CGAAGCTTCAAGTG-TGCCTTTTTTCTCTCTT-3′，預(yù)計擴增長度為529 bp。

取10 g新鮮無菌豬肝臟組織(采自江蘇淮安某生豬養(yǎng)殖場)進行研磨，使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2提取總RNA，采用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板擴增豬pIFN-δ5片段。PCR擴增體系50 μL：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ雙酶切，膠回收獲得線性化載體；按照重組酶說明書將pIFN-δ5片段與線性化pET-32a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌液經(jīng)PCR鑒定后挑取陽性克隆，使用EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ雙酶切，并送南京擎科生物科技有限公司進行測序，重組質(zhì)粒命名為pET-pIFNδ5。

1.3 pIFN-δ5的表達、純化及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-pIFNδ5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆菌于37 ℃培養(yǎng)，當D600 nm值達到0.5～0.6，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，37 ℃恒溫繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，低溫條件下超聲破碎，高速離心分別收集上清與沉淀，12.5% SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。取pET-pIFNδ5菌液擴大培養(yǎng)至4 L，離心收集菌體后，使用200 mL Buffer A(20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、5%甘油，pH 7.5)重懸，高壓破碎3次，13 000 r/min離心30 min，取上清；按照His純化層析柱PurKine His-Tag Ni-NTA Packed Column操作說明對上清進行純化，使用Buffer A平衡，使用Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、250 mmol/L咪唑、5%甘油，pH 7.5)洗脫；使用PD SpinTrap G-25脫鹽柱將洗脫樣品脫鹽至PBS中，獲得純化蛋白。純化后的蛋白采用高效液相色譜(HPLC)檢測純度，條件為：SEC-HPLC柱；流動相為PBS；流速為0.5 mL/min；進樣體積為10 μL；運行30 min。

純化的pIFN-δ5蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以小鼠抗6×His標簽抗體(1∶2 000稀釋)為一抗、山羊抗鼠IgG-HRP(1∶10 000稀釋)為二抗進行Western blotting鑒定。使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pIFN-δ5的比活性測定

參考文獻[17-18]，使用VSV/MDBK系統(tǒng)測定pIFN-δ5比活性。將MDBK細胞鋪96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層，設(shè)置不加pIFN-δ5和VSV空白對照、不加pIFN-δ5加VSV陽性對照、加pIFN-δ5不加VSV陰性對照；細胞使用D-Hank’s液清洗2次，用含2% FBS的DMEM將純化的pIFN-δ5按照2×101、2×102、2×103、2×104、2×105、2×106稀釋度進行倍比稀釋，每孔加入倍比稀釋的pIFN-δ5 100 μL，每個稀釋度設(shè)5個重復(fù)，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；細胞用D-Hank’s液洗2次，每孔加入含100 TCID50的VSV溶液100 μL。以細胞病變效應(yīng)作為判定結(jié)果，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至空白對照組無細胞病變，陰性對照組無細胞病變，陽性對照組75%以上細胞出現(xiàn)病變時，計算pIFN-δ5比活性效價。

1.5 pIFN-δ5的細胞毒性測定

采用CCK8方法檢測pIFN-δ5對細胞增殖的影響[19]。取IPEC-J2細胞鋪96孔板，待長滿單層，加入含不同濃度(10、50、100 ng/mL)pIFN-δ5的細胞維持液(含有2% FBS的DMEM)，并設(shè)立單獨維持液對照(0 ng/mL)，37 ℃分別孵育4、8、12、16、24和36 h；吸棄維持液，加入100 μL含有10% CCK8試劑的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。試驗重復(fù)3次，使用測得樣品與對照D450 nm值的比值進行結(jié)果判定。

1.6 pIFN-δ5的抗病毒檢測

參考Zhang等[20]方法檢測pIFN-δ5的抗病毒活性。取IPEC-J2細胞鋪24孔板，待細胞匯合度至80%，加入含有不同濃度(0、5、10、50 ng/mL)的pIFN-δ5細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進行預(yù)處理；吸棄維持液并使用無菌PBS洗滌3次，采用含100 TCID50PEDV變異株AH2012/12和5 μg/mL胰酶無血清培養(yǎng)基孵育細胞，37 ℃作用1 h，洗滌3次；加入含相同預(yù)處理濃度的pIFN-δ5、5 μg/mL胰酶無血清維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并按照相同處理方式設(shè)置無pIFN-δ5處理未接毒的對照組(NC)；接毒后24 h收取細胞上清樣品，進行PEDV基因拷貝數(shù)的檢測[19,21-22]；使用無水乙醇和蛋白裂解液分別固定和裂解細胞樣品，進行PEDV N蛋白的間接免疫熒光、Western blotting測定及其蛋白灰度分析[19]，綜合評價原核表達重組蛋白pIFN-δ5對PEDV的抗病毒效果。

1.7 統(tǒng)計分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件對測定后數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)及后續(xù)Tukey檢驗，結(jié)果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET-pIFNδ5的構(gòu)建與鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在529 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符(圖1A)。通過重組連接方法篩選獲得重組質(zhì)粒pET-pIFNδ5，經(jīng)EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ雙酶切獲得片段大小分別約為5 900和529 bp(圖1B)，與pET-32a(+)空載體質(zhì)粒及目的條帶大小一致。對重組質(zhì)粒測序所獲序列進行比對發(fā)現(xiàn)，與GenBank中pIFN-δ5序列(登錄號：NM_001164854.1)一致，未發(fā)現(xiàn)突變。

M1，DL2000 DNA Marker；1，陰性對照；2，pIFN-δ5基因PCR擴增；3，pET-pIFNδ5雙酶切鑒定；M2，1 kb plus DNA MarkerM1，DL2000 DNA Marker；1，Negative control；2，PCR amplification of pIFN-δ5 gene；3，Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-pIFNδ5；M2，1 kb plus DNA Marker圖1 pIFN-δ5基因的PCR擴增(A)及重組質(zhì)粒pET-pIFNδ5的雙酶切鑒定(B)Fig.1 PCR amplification of pIFN-δ5 gene (A) and double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-pIFNδ5 (B)

2.2 pIFN-δ5蛋白的可溶性表達分析

將pET-pIFNδ5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落培養(yǎng)并誘導表達后，超聲裂解獲得菌體上清和包涵體，對其進行SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)，pET-pIFNδ5誘導表達后上清中出現(xiàn)與預(yù)期大小(約35 ku)一致的蛋白條帶(圖2A)；進一步對菌體上清進行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在約35 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖2B)。表明pET-pIFNδ5成功表達，且目的蛋白表達于上清。

①A，SDS-PAGE分析；B，Western blotting檢測。②M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，空載體誘導上清；2，空載體誘導沉淀；3，pET-pIFNδ5未誘導上清；4，pET-pIFNδ5未誘導沉淀；5，pET-pIFNδ5誘導上清；6，pET-pIFNδ5誘導沉淀；7、8，pET-pIFNδ5誘導上清樣品①A，SDS-PAGE analysis；B，Western blotting detection.②M，Protein Marker；1，Supernatant of induced empty vector；2，Precipitate of induced empty vector；3，Supernatant non-induced of pET-pIFNδ5；4，Precipitate of non-induced pET-pIFNδ5；5，Supernatant of induced pET-pIFNδ5；6，Precipitate of induced pET-pIFNδ5；7 and 8，The induced supernatant samples of pET-pIFNδ5圖2 重組質(zhì)粒pET-pIFNδ5的誘導表達Fig.2 Induced expression of recombinant plasmid pET-pIFNδ5

2.3 pIFN-δ5蛋白的表達及純化

由圖3可知，洗脫樣品中含有與預(yù)期大小一致的純化目的蛋白，經(jīng)濃度測定為1.0 mg/mL。經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白純度高達97.86%(圖4)。

2.4 pIFN-δ5純化蛋白的比活性測定

由表1可知，純化的pIFN-δ5蛋白能有效抑制VSV對MDBK細胞的致病變，并表現(xiàn)出明顯的抗VSV活性，病毒陽性對照組細胞病變效應(yīng)超過75%，空白和陰性對照組無細胞病變效應(yīng)；以抑制50%細胞病變的最高稀釋倍數(shù)作為干擾素比活性，經(jīng)計算，pIFN-δ5的干擾素比活性為5×104U/mg；依據(jù)純化的pIFN-δ5質(zhì)量濃度1.0 mg/mL，故pIFN-δ5的比活性為5×104U/mg。

圖4 HPLC法檢測pIFN-δ5蛋白純度Fig.4 Determination of purity of pIFN-δ5 protein by HPLC method

表1 不同濃度pIFN-δ5對VSV的抑制效果

2.5 pIFN-δ5純化蛋白的細胞毒性測定

采用CCK8方法檢測pIFN-δ5蛋白對IPEC-J2細胞增殖能力的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，與對照組IPEC-J2細胞相比，100 ng/mL pIFN-δ5作用36 h對IPEC-J2細胞的增殖能力有顯著抑制作用(P<0.05)，表明較高濃度pIFN-δ5具有一定的細胞毒性作用。

表2 pIFN-δ5純化蛋白對IPEC-J2細胞的毒性測定

2.6 pIFN-δ5抗PEDV感染的效果測定

采用不同濃度pIFN-δ5處理并測定其抗PEDV感染能力，結(jié)果顯示，與0 ng/mL pIFN-δ5組相比，10和50 ng/mL pIFN-δ5組細胞上清中PEDV基因拷貝數(shù)顯著或極顯著降低(P<0.05；P<0.01)(圖5A)。Western blotting及蛋白條帶灰度比值結(jié)果顯示，與0 ng/mL pIFN-δ5組相比，PEDV N蛋白表達量顯著下調(diào)，其中10和50 ng/mL pIFN-δ5組分別存在顯著差異和極顯著降低(P<0.05；P<0.01)(圖5B、5C)。間接免疫熒光結(jié)果顯示，隨著pIFN-δ5處理濃度的增加，PEDV陽性感染細胞數(shù)顯著或極顯著減少(P<0.05；P<0.01)(圖6A、6B)。表明pIFN-δ5具有顯著的抗PEDV感染的能力，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

①A，PEDV基因拷貝數(shù)分析；B，Western blotting檢測；C，蛋白條帶灰度分析.②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同①A，PEDV gene copy number analysis；B，Western blotting detection；C，Protein band gray scale analysis.②*，Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01).The same as below圖5 病毒基因拷貝數(shù)及N蛋白表達量測定pIFN-δ5抗PEDV感染效果Fig.5 Theviral gene copy number and N protein expression assays of pIFN-δ5 against PEDV infection

A，間接免疫熒光分析；B，PEDV N蛋白表達陽性細胞數(shù)測定A，Immunofluorescence analysis；B，PEDV N protein expression positive cell number assay圖6 免疫熒光測定pIFN-δ5抗PEDV感染效果Fig.6 The immunofluorescence assay detection of pIFN-δ5 against PEDV infection

3 討 論

IFN作為最重要的一種先天性免疫分子，在抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用。本研究采用原核表達系統(tǒng)表達并純化了pIFN-δ5蛋白，并對其抗PEDV感染效果進行了初步的測定，發(fā)現(xiàn)pIFN-δ5在10 ng/mL低濃度作用下便具有顯著的抑制PEDV感染能力，表現(xiàn)出較高的抗病毒活性。PEDV的靶器官為腸道，而Ⅲ型IFN-λ在腸道等黏膜感染中發(fā)揮著重要的作用。與Ⅰ型IFNs不同，Ⅲ型IFN-λ主要由上皮細胞、NK細胞和樹突狀細胞(DC)產(chǎn)生，且主要作用于黏膜上皮[10,23-24]，這些特征使IFN-λ成為抗局部黏膜感染的潛在候選藥物[25]。而IFN-δs屬于Ⅰ型IFNs，具有11個亞型[26]，不同亞型間抗病毒活性差異很大，如IFN-δ8具有抗偽狂犬病病毒和口蹄疫病毒感染作用[20,27]。鑒于pIFN-δ5在PEDV感染的仔豬腸道組織中呈上調(diào)趨勢，本研究選取該亞型IFN-δ進行了原核表達純化及其抗PEDV感染作用分析。

IFN通過誘導下游的IFN刺激基因(ISG)的表達而發(fā)揮其抗病毒作用。研究發(fā)現(xiàn)，3種豬IFNs(IFN-α、IFN-λ1和IFN-λ3)均可引起IPEC-J2細胞中抗病毒基因ISG15、OASL、MxA和IFITM1的表達[28]。但是，不同的IFNs誘導ISGs的程度不同，如IFN-α更強烈地上調(diào)了IFITM1表達，而pIFN-λs誘導了更高水平的ISG15和MxA[13]。本研究使用純化的pIFN-δ5孵育IPEC-J2細胞，對多種ISGs基因的表達進行了測定，初步發(fā)現(xiàn)Mx1、ISG15和OAS2等多個ISGs呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，表明pIFN-δ5具有誘導多種ISGs的能力，但pIFN-δ5誘導ISGs發(fā)揮抗病毒作用是否與其他型IFNs存在不同，還需要進一步深入研究。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在pIFN-δ5蛋白表達條件的優(yōu)化中，加入誘導劑IPTG誘導4 h后，pIFN-δ5蛋白大部分表達于上清中；而繼續(xù)延長表達時間，雖然蛋白表達量會上升，但表達形式會變成包涵體。所以本研究采用誘導表達4 h后收集菌體，進行蛋白的純化。IFN的比活性是反映其抗病毒效果的重要指標。先前的多項研究對豬的IFN-α和IFN-λ進行了原核、桿狀病毒和酵母等不同形式的表達及純化，測定的IFN比活性介于103～106U/mg之間[29-31]。本研究中pIFN-δ5的比活性為5×104U/mg，處于中間水平，且其蛋白純度較高(97.86%)，難以通過提高純度提升比活。但是該亞型IFN的腸道高表達特性及對PEDV的高抑制能力均表明，pIFN-δ5可能在抗豬腹瀉相關(guān)病毒病中具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了pIFN-δ5的原核表達質(zhì)粒，經(jīng)誘導條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)pIFN-δ5可表達于上清；經(jīng)大量表達純化獲得純度>95%的純化蛋白，其比活性為5×104U/mg，且pIFN-δ5具有顯著的抑制PEDV感染能力。