豬輪狀病毒江西株AY01的分離鑒定

劉小蘭，劉昌錦，余文洋，李瀟翔，邊彥超，黃校花，羅 鋒，鄧舜洲

(1.江西農業大學動物科學技術學院，南昌 330045；2.江西金伊博生物科技有限公司，南昌 330013)

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)是導致哺乳仔豬和斷奶仔豬腹瀉的常見病原之一，屬呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員[1]。感染PoRV后，發病豬主要表現厭食、嘔吐、水樣腹瀉等特征，PoRV在世界范圍的流行非常普遍，各種年齡、性別的豬均可感染，主要危害1～4周齡仔豬，尤其1～10日齡仔豬感染后發病率可超過80%，死亡率為50%～100%[2-3]，成年豬多為隱性感染，該病潛伏期短、傳染性強、流行范圍廣，給養豬業造成巨大的經濟損失。

PoRV為無囊膜正鏈 RNA 病毒，具有二十面體立體對稱的雙層衣殼，直徑在65～75 nm之間，在電鏡下，可觀察到形似“車輪狀”的病毒粒子[4]。病毒核酸由11個雙股RNA基因片段組成，每一基因片段各編碼一種蛋白，其中VP1～VP4、VP6、VP7為結構蛋白，NSP1～NSP6為非結構蛋白[5]。VP6是數量最多的結構蛋白，是病毒的群抗原，根據VP6可將輪狀病毒分為10個基因群(A～J)，其中A群輪狀病毒(RVA)是最典型的輪狀病毒。輪狀病毒的基因型主要根據病毒表面的VP4和VP7蛋白分型，分別為P、G血清型，目前在人和動物的RVA中發現35個P血清型和27個G血清型[6]。

1969年輪狀病毒在犢牛中首次被報道[7]，隨后1975年Rodger等[8]在豬糞便中分離到PoRV，中國于1982年由龐其方等[9]在腹瀉仔豬糞便中分離出該病毒，隨后陸續有學者在馬、羊、雞等多種動物的腹瀉糞便中發現輪狀病毒。PoRV在全球范圍內廣泛分布，以豬RVA最為常見，其復雜的流行病學、遺傳多樣性被廣泛研究，在豬群中的患病率在3.3%～67.3%之間，豬場陽性感染率為61%～74%[10-11]，此病毒的感染傳播高發季為早春、冬季和晚秋這些溫度較低時節[12]。PoRV常與多種豬源性傳染病混合感染仔豬，導致PoRV的流行很復雜。本試驗從疑似PoRV感染的豬場采集病料，對此病毒的分離培養條件進行探究，利用MA104細胞分離獲得1株PoRV，觀察該分離株人工感染新生仔豬后的臨床表現和剖檢病理學變化，以期為PoRV的流行情況提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、細胞系和試驗動物 病料為江西南昌某規模化豬場腹瀉仔豬的小腸樣品，-80 ℃保存備用；MA104細胞(CRL-2378.1)、Vero細胞(CCL-81)、PK15細胞(CCL-33)、MARC-145細胞(CRL-12231)、McCoy細胞(CRL-1696)、ST細胞(CRL-1746)、IEC-18細胞(CRL-1589)、IPEC-J2細胞均由江西農業大學預防獸醫室保存；1日齡未吃初乳初生仔豬購自江西省某規模化豬場。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM細胞培養液、胎牛血清(Gibco公司)；反轉錄酶M-MLV、RRI試劑(TaKaRa公司)；胰酶、羊抗鼠FITC-IgG抗體(Solarbio公司)；鼠抗輪狀病毒VP6蛋白高免血清(效價1∶5.12×105至1∶10.24×105)由江西農業大學預防獸醫教室制備保存；一步法反轉錄實時熒光定量檢測試劑盒(GenStar公司)。

1.2 病料處理

取小腸組織用無菌勻漿器勻漿后，按比例制成1∶10的DMEM懸液，反復凍融3次，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，用0.22 μm細菌濾器過濾上清液，-80 ℃保存備用。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank中收錄的輪狀病毒VP4基因序列(登錄號：KC113250.1)設計1對VP4基因全長的測序引物；參考GenBank上收錄的A型輪狀病毒的VP7基因序列(登錄號：MT025938.1)設計2對引物，分別作為檢測引物和VP7基因全長的測序引物；參考CV777毒株的ORF1基因序列(登錄號：LT906581.1)設計豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的檢測引物；參考HE-1毒株的N基因序列(登錄號：KX083668.1)設計豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的檢測引物，引物序列見表1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 RT-PCR擴增

采用TRIzol法提取病毒總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，以其為模板進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL：cDNA模板2 μL，HiFi Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，HiFi酶0.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共37個循環；72 ℃延伸8 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 病毒分離培養

在病毒濾液中加入終濃度為15 μg/mL的胰酶，37 ℃處理1.5 h。取出匯合度約90%的MA104細胞，棄去培養液，并用無血清的DMEM洗3遍，將處理好的樣品接種于細胞，37 ℃吸附2 h，加入含終濃度為7.5 μg/mL胰酶的DMEM維持液，繼續培養48 h后收集病毒液，反復凍融3次，即為第1代P1分離株，收集培養液進行下一代在MA104細胞上盲傳，直至產生細胞病變，同時收集每代的細胞培養物進行RT-PCR擴增鑒定。

1.6 病毒鑒定

1.6.1 病毒VP4、VP7基因RT-PCR鑒定 提取分離毒株的第5(P5)和第10代(P10)細胞培養物的RNA，將其反轉錄為cDNA，以此為模板，分別用VP4、VP7基因特異性引物進行PCR擴增，擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產物送至湖南擎科生物技術有限公司測序。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對分析，從GenBank中查找到PoRVVP4和VP7各型的參考毒株，利用Mega 7.0軟件構建VP4、VP7基因的系統進化樹，確定分離株的基因型。

1.6.2 病毒間接免疫熒光試驗鑒定 將MA104細胞接種于96孔細胞培養板，細胞長成單層后接種病毒液，37 ℃培養48 h后棄上清，預冷甲醇固定，以鼠抗VP6蛋白多克隆抗體(1∶2 000)為一抗、羊抗鼠FITC-IgG(1∶500)為二抗對病毒進行染色檢測，于倒置熒光顯微鏡下觀察檢測結果。

1.6.3 病毒電鏡觀察 收集分離株細胞培養物，病毒液反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，離心上清經蔗糖濃縮后透析，過0.22 μm細菌濾器，收集濾液經磷鎢酸負染后用日立HT7700透射電鏡觀察病毒形態。

1.7 病毒部分生物學特性檢測

1.7.1 病毒增殖曲線繪制 取出匯合度約90% MA104細胞，用無血清培養液洗3次，以感染復數(MOI)為0.05的病毒量感染，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h后，棄病毒液，每孔補加含5 μg/mL胰酶的無血清DMEM維持液，每隔4 h刮取細胞，收集病毒液。將各時間點收集的病毒液分別按照10倍倍比稀釋，從10-1稀釋至10-8，接種于已鋪滿MA104細胞的96孔細胞培養板，并設正常細胞作為對照，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 d后。利用間接免疫熒光試驗進行熒光染色觀察，按照Reed-Muench法計算各時間點的50%組織細胞感染量(TCID50)，并以時間為橫坐標、各時間點的TCID50為縱坐標，繪制病毒的增殖曲線。

1.7.2 分離毒株對不同細胞的易感性 將MA104、Vero、IPEC-J2、PK15、MARC-145、McCoy、ST、IEC-18細胞分別接種于96孔細胞培養板中培養，待細胞鋪滿培養板后，用無血清的DMEM培養液洗3次，以MOI為0.05的病毒量感染分離毒株，置于37 ℃、5% CO2培養箱中吸附2 h，棄病毒液，每孔補加含5 μg/mL胰酶的無血清DMEM維持液，同時設置相應的正常細胞作為對照，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 d后棄培養液，固定，進行間接免疫熒光檢測。

1.8 動物回歸試驗

將4頭1日齡未吃初乳的新生仔豬隨機分組，其中試驗組3頭，對照組1頭，試驗組仔豬經人工口服分離株第20代細胞培養液，1 mL/頭(病毒含量106.0TCID50/mL)，對照組仔豬口服等體積DMEM。每隔2 h飼喂仔豬專用豬奶粉，每隔4 h采集糞便拭子，并記錄試驗仔豬的食欲及精神狀況，攻毒后48 h剖殺。參考許夢怡等[13]建立的PEDV、TGEV、PoRV的多重熒光定量PCR檢測方法，應用一步法反轉錄實時熒光定量檢測試劑盒檢測糞便排毒情況。上游引物：5′-CGCGGAGCTAAACGTGAAAA-3′；下游引物：5′-TTACTCTCCATAATTGCGTCTATGTTC-3′；探針：5-(ROX)-CCACAACAGAATGAACGTCTGC-AAGAAAAA-(BHQ2)-3′。PCR反應體系20 μL：2×StarScript Ⅱ Probe One-Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScript Ⅱ Probe One Step Enzyme Mix 2 μL，探針(10 μmol/L) 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，RNA模板 2 μL，DEPC水補至20 μL。PCR反應程序：50 ℃ 15 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。試驗結束后，剖檢，收集仔豬小腸樣品，用4%多聚甲醛固定，用于HE病理切片染色和免疫組織化學檢測。

2 結 果

2.1 病料RT-PCR檢測

對處理好的病料樣品進行RT-PCR，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果表明PoRV-F/R引物擴增產物電泳后可見約503 bp的擴增條帶，與預期大小相符，而使用PEDV和TGEV特異性引物未擴增出特異性條帶(圖1)，表明該病料樣品含PoRV。

M，DL2000 DNA Marker；1、4、7，病料樣品；2，PoRV陽性對照；5，PEDV陽性對照；8，TGEV陽性對照；3、6、9，陰性對照M,DL2000 DNA Marker;1,4 and 7,Sick material samples;2,PoRV positive control;5,PEDV positive control;8,TGEV positive control;3,6 and 9,Negative control圖1 樣品PoRV RT-PCR檢測結果Fig.1 RT-PCR detection results of samples for PoRV

2.2 病毒分離

病料濾液經胰酶處理后接種MA104單層細胞，盲傳細胞第1～3代無明顯變化；第4～5代細胞在48 h脫落細胞增多；傳至第6代時，16～24 h時產生明顯的細胞病變，具體表現為細胞變圓皺縮，出現拉網現象并逐漸脫落(圖2A)，未感染的MA104細胞正常生長(圖2B)。繼續傳代后，分離毒株逐漸適應MA104細胞，將該毒株命名為PoRV AY01株。

A，AY01毒株感染的MA104細胞；B，正常MA104細胞A,MA104 cells infected with AY01 strain;B,Normal MA104 cells圖2 分離株感染MA104細胞時的細胞病變(100×)Fig.2 Cytopathic effect of the isolated strain on MA104 cells (100×)

2.3 分離株鑒定結果

2.3.1VP4和VP7基因檢測結果 提取分離株的P5和P10代細胞培養液進行RT-PCR，RT-PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果見圖3、4。結果顯示在約2 331和1 035處出現目的條帶，分別與預期VP4、VP7基因片段大小相符。

M，DNA Marker Ⅳ，1，陽性對照；2，P5代細胞培養物；3，P10代細胞培養M,DNA Marker Ⅳ; 1,Positive control; 2,P5 generation cell culture; 3,P10 generation cell culure圖3 AY01株VP4基因RT-PCR擴增結果Fig.3 RT-PCR amplification result of VP4 gene of AY01 strain

M，DL2000 DNA Marker；1，陽性對照；2，P5代細胞培養物；3，P10代細胞培養物M,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,P5 cell culture;3,P10 cell culure圖4 AY01株VP7基因RT-PCR擴增結果Fig.4 RT-PCR amplification result of VP7 gene of the AY01 strain

2.3.2 分離株基因型鑒定及基因進化樹分析 對分離株VP4基因測序結果經BLAST在線比對，結果顯示，分離株與PoRV的VP4基因相似性達96.65%，確定分離株VP4基因為P[23]型。系統進化樹結果顯示，AY01株的VP4基因與四川的豬輪狀病毒SCYB-C3株(MT198752.1)的親緣關系最近(圖5)。分離株VP7基因測序結果經BLAST在線比對，結果顯示，分離株與PoRVVP7基因相似性達97.78%，確定分離株VP7基因為G5型。系統進化樹結果顯示，AY01株的VP7基因與黑龍江的豬輪狀病毒Zjh3-2株(JX498961.1)的親緣關系最近，同時與中國流行血清型G5型的代表毒株OSU在進化關系上構成一個分支(圖6)。因此分離毒株的基因型為G5P[23]型。

圖5 AY01株VP4基因核苷酸序列系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of VP4 gene of AY01 strain

圖6 AY01株VP7基因核苷酸序列系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of VP7 gene of AY01 strain

2.3.3 間接免疫熒光試驗結果 將分離毒株的細胞培養液接種MA104細胞，以鼠抗VP6蛋白多克隆抗體為一抗、羊抗鼠FITC-IgG為二抗進行間接免疫熒光試驗，結果顯示，感染病毒的孔內細胞胞漿內可見特異性綠色熒光(圖7A)，正常MA104細胞孔內未見熒光(圖7B)。

A，AY01毒株感染的MA104細胞；B，正常MA104細胞A,MA104 cells infected with AY01 strain;B,Normal MA104 cells圖7 PoRV AY01株感染MA104細胞間接免疫熒光試驗檢測結果(100×)Fig.7 IFA test results of MA104 cells infected with PoRV AY01 strain (100×)

2.3.4 病毒電鏡觀察結果 PoRV AY01株細胞培養物經超速離心純化，負染后進行透射電鏡觀察，電鏡下可看到形態呈球形，具有明顯的雙層衣殼結構，似車輪狀的病毒顆粒，直徑大小為61～70 nm，平均大小65 nm(圖8)。

圖8 PoRV AY01株病毒粒子電鏡觀察 (20 000×)Fig.8 Electron micrograph of virus particle of PoRV AY01 strain (20 000×)

2.4 分離毒株的部分生物學特性檢測結果

2.4.1 分離毒株增殖曲線的繪制 由圖9可知，分離株AY01在接毒后8～12 h就可達到病毒滴度峰值，隨后進入病毒增殖穩定期(圖9)。

圖9 PoRV AY01株的增殖曲線Fig.9 Proliferation curve of PoRV AY01 strain

2.4.2 分離毒株對不同細胞的易感性 間接免疫熒光試驗結果顯示，分離毒株對試驗所用細胞有感染，可用免疫熒光方法檢測PoRV。在可見光下，分離株在MA104、Vero、IPEC-J2、PK15細胞中產生細胞病變，在ST、McCoy、IEC-18細胞中無細胞病變；經免疫熒光檢測，分離株在MA104、Vero細胞中可檢測到大面積的熒光，其中毒株在MA104細胞的胞漿內可見特異性綠色熒光，在Vero細胞的細胞核中能檢測到特異性綠色熒光，在IPEC-J2、PK15細胞中的熒光較少，在ST、McCoy細胞中只有零星的熒光，在MARC-145、IEC-18細胞中無熒光(圖10)。綜上得出，分離毒株在所用細胞中的易感性排序為MA104>Vero>IPEC-J2>PK15>ST>McCoy>MARC-145>IEC-18細胞，表明PoRV分離株在MA104細胞上的易感性最好。

圖10 分離毒株AY01對不同細胞的易感性(100×)Fig.10 Susceptibility of isolated strain AY01 to different cells (100×)

2.5 動物回歸試驗

2.5.1 臨床癥狀及剖檢變化 試驗組3頭仔豬接種AY01株后，8～24 h時3頭豬排軟糞，24～48 h時均陸續由黃色軟糞轉為水樣腹瀉，具體表現為精神沉郁、嗜睡，飲食量嚴重下降，排黃色水樣稀糞便，并伴有腥臭味，48 h時剖檢攻毒組仔豬可見胃內有未消化的凝乳，小腸腸壁變薄、出血，腸內有黃色液體。試驗期間，對照組仔豬未出現上述癥狀。表明分離毒株AY01株攻毒可致使仔豬持續排毒，并產生典型腹瀉癥狀。

2.5.2 PoRV感染后排毒檢測 試驗期間每4 h收集2組仔豬肛門拭子，利用一步法實時熒光定量PCR方法監測排毒情況，結果顯示，在24～48 h時Ct值變化明顯，36～44 h降到最低(圖11)，此時仔豬臨床表現為飲食量下降，精神萎靡，腹瀉嚴重，排黃色水樣糞便。

圖11 仔豬接種PoRV AY01株后糞便排毒檢測Fig.11 Detection of fecal detoxification in piglets inoculated with PoRV AY01 strain

2.5.3 病理組織及免疫組化切片觀察 病理組織切片觀察結果顯示，試驗組仔豬小腸絨毛呈彌漫性萎縮、絨毛減少，脫落(圖12A)，對照組腸道結構完整，未見壞死脫落(圖12C)。免疫組化檢測結果顯示，試驗組仔豬腸絨毛及黏膜層處分散有褐色點狀物(圖12C)，為PoRV陽性；對照組仔豬腸道均正常(圖12D)。

3 討 論

PoRV在豬群中的感染非常普遍，在中國規模化豬場仔豬腹瀉糞便中的陽性率為7.69%～28.76%[14-17]，早期分離的PoRV很難適應細胞，直到1984年Bohl等[18]首次用胰酶處理樣品，感染MA104細胞，開啟了PoRV的體外分離培養進程，Benureau[19]證實胰酶能結合輪狀病毒顆粒，溶解其外殼蛋白，從而增強病毒的感染能力。隨著現代生物科技的發展，對PoRV的分離培養技術逐漸成熟，目前的輪狀病毒體外培養是否成功主要由細胞種類、胰酶濃度以及糞液中病毒粒子的完整性等因素決定，其中胰酶在輪狀病毒增殖時有重要作用，時洪艷等[20]在處理病料時加入20 μg/mL胰酶消化，從MA104細胞上分離到1株PoRV。陳淑紅等[21]則使用30 μg/mL胰酶消化處理才從MA104細胞上分離到PoRV毒株。楊娟[22]僅加入0.1 μg/mL胰酶消化處理病料便從Vero細胞上分離到PoRV SWU-1C/2018株。本研究將病料濾液經終濃度15 μg/mL胰酶預處理，在維持液中添加終濃度7.5 μg/mL胰酶為分離培養PoRV的條件，成功分離到1株PoRV，將該毒株命名為PoRV AY01株。AY01株在MA104細胞上盲傳至第6代后表現穩定的細胞病變，具體表現為細胞折光性增強、拉網脫落等，這與張賀偉等[23]、黃小波等[24]結果一致。PoRV在體內只感染腸絨毛的上皮細胞，在體外能感染腎或腸道上皮細胞，其中最敏感的是MA104細胞，隨后發現用胰酶處理的輪狀病毒也能在ST、MARC-145、PK15、Vero等細胞上增殖[25-27]，本試驗分離株能夠在MA104、Vero、IPEC-J2、PK15、ST、McCoy、MARC-145細胞中增殖，其易感性排序為MA104>Vero>IPEC-J2>PK15>ST>McCoy>MARC-145>IEC-18細胞，進一步驗證MA104細胞是分離輪狀病毒的最佳選擇。

輪狀病毒基因型和血清型很多，且在自然界中還存在著人與動物、動物與動物之間的基因片段重組現象[28-30]，RVA的基因型眾多，且G型與P型之間會產生不同的組合，不同組合型的RVA毒株的交叉保護性很低[31-32]。目前，RVA中與豬相關的輪狀病毒G血清型有12種，P血清型16種，其中在中國流行的PoRV G血清型為G3、G4、G5、G9、G11和G26，通常會與P[5]、P[6]、P[7]、P[13]、P[23]組合的形式流行[33-34]。在本試驗中，分離株的VP4基因與P[23]型的PoRV SCYB-C3株親緣關系最近，相似性為96.65%，VP7基因與G5型的PoRV Zjhzl3-2株和OSU/USA株相似性分別為97.78%和93.8%，據Matthijnssens等[6]提出的“輪狀病毒VP4編碼區核苷酸序列相似性>90%，即為同一基因型，輪狀病毒VP7編碼區核苷酸序列相似性>80%，即為同一基因型”的劃分方法，確定AY01株屬于G5P[23]型PoRV。在眾多PoRV G/P組合型中，G5P[7]型PoRV是全球流行最廣泛的組合型，占所有PoRV的37.3%[35]，但隨著RVA基因片段間重組頻繁，近年來在中國陸續報道了G11P[13]、G9P[23]、G9P[7]、G4P[13]、G26P[13]等新型組合的PoRV[36-38]，本試驗報道了一種新組合型PoRV AY01株，豐富了國內PoRV的資料，有利于對國內PoRV的監測。

目前，國內關于PoRV分離的報道越來越多，但關于PoRV對豬致病性的相關報道較少。本試驗開展PoRV AY01毒株人工感染仔豬的致病性研究，為防止仔豬母源抗體對試驗的影響，選擇1日齡新生未吃初乳的仔豬為試驗對象，仔豬經口感染分離毒株，在攻毒后24～48 h期間，仔豬表現嘔吐、腹瀉、排黃色水樣并伴有腥臭的稀糞的癥狀，剖檢可見各腸段脹氣明顯，小腸腸壁變薄，腸系膜充血腫脹，小腸絨毛萎縮，腸上皮細胞脫落、壞死。黃小波等[24]使用3日齡仔豬感染PoRV OSU株，在感染10 h后，仔豬開始腹瀉，拉黃色水樣稀糞，感染42 h后仔豬脫水死亡。Narita等[39]通過對8頭口服PoRV的新生仔豬的腸道病變進行研究時，發現感染PoRV的仔豬在接種后18～24 h表現腹瀉，腸絨毛脫落、萎縮，特別是空腸和回腸的變性，這與本試驗分離株感染仔豬的癥狀和病理切片觀察結果一致。此外，在整個試驗過程中，使用實時熒光定量PCR方法對試驗組仔豬糞便排毒情況進行檢測，發現試驗組仔豬均在24～48 h期間Ct值變化明顯，36～44 h降到最低，此時仔豬臨床表現為腹瀉、嘔吐、排黃色水樣糞便等典型的PoRV癥狀，表明此時是仔豬糞便排毒的高峰期。因此，初步得出PoRV在進行動物致病性研究時，可結合仔豬臨床與實時熒光定量PCR方法，對試驗過程進行監測，當發病癥狀表現明顯及Ct值最低時處死仔豬，能最大程度得到病毒含量高的病料樣品。

4 結 論

本試驗成功分離到1株基因型為G5P[23]型的PoRV，為了解江西地區PoRV的流行變異情況及有效防治PoRV感染提供了參考依據。