拜城油雞FSHR基因多態性及其與生產性能的關聯分析

丁夢琴，黑達西·巴哈提，彭鳳強，胡雅麗，沙爾山別克·阿不地力大

(新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

促卵泡激素受體(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)由顆粒細胞分泌，屬于G蛋白偶聯受體家族成員，具有7個插入胞膜的疏水螺旋結構，存在于卵巢顆粒細胞膜上，由676個氨基酸殘基組成，是促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)的特異性受體[1]。FSH是由垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，是一種生物大分子，不能自主透過細胞內發揮其生物學功能及作用，必須通過存在于卵巢顆粒細胞膜上的FSHR介導將FSH運送到細胞內，進而將信息傳遞到靶細胞膜內[2]，當激素FSH與FSHR胞外域相互作用后就啟動了級聯反應，直接引發促性腺激素特定的生物學效應。FSH與FSHR結合后，在活化芳香化酶的誘導下生成促黃體素(luteinizing hormone，LH)受體，可誘發排卵。因此FSHR對動物卵巢卵泡的發育、成熟和排卵具有重要作用[3]。目前，國內外對FSHR基因多態性的研究主要集中在豬、羊等哺乳動物，且FSHR基因多態性與哺乳動物產仔數密切關聯[4-6]。目前，FSHR基因對家禽生產性能的影響報道較少。本研究以拜城油雞為試驗對象，采取DNA混池重測序技術篩選SNP，再通過Sequenom飛行時間質譜技術進行相關的位點分型，檢測拜城油雞FSHR基因多態性，并分析其與產蛋性能、蛋品質及孵化性能的相關性，以期為拜城油雞生產性狀的基因標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 試驗在新疆烏魯木齊市米東區長山子鎮昊翔養殖專業合作社開展，隨機挑選126日齡健康拜城油雞母雞150只，在相同飼養環境及飼糧水平下飼養。試驗雞均置于3層階梯籠同層飼養，自由飲水，每天光照時間16 h，光照強度10 lx，采用常規的玉米-豆粕型飼糧，每天分別于08:00和19:00供料2次，其他飼養管理按種雞場常規進行。在300日齡時采集血液，EDTA抗凝，-20 ℃保存，用于基因組DNA提取。

1.1.2 測定指標及方法 產蛋性能：每天18:00收集雞蛋，分別記錄各試驗雞開產蛋重、開產日齡、開產體重、300日齡總產蛋數、300日齡平均產蛋重，統計300日齡內每只雞產蛋率。

蛋品質測定：在產蛋初期、產蛋中期及300日齡時分別收集每只雞蛋并做標記，測定蛋品質。采用多功能蛋品質分析測定儀(EA-01，ORKA公司)測定蛋重、哈氏單位、蛋白高度和蛋黃顏色；采用游標卡尺測定雞蛋縱徑和橫徑、蛋殼鈍端、中部、銳端厚度，求蛋形指數和蛋殼厚度值。

孵化率測定：在群體產蛋率達50%后，每天收集每只雞蛋并做好標記，剔除不合格種蛋，放入蛋庫，每隔5～8 d入孵一批種蛋，入孵前記錄每只雞的入孵蛋數。種蛋入孵后，根據孵化場的照蛋情況，挑出入孵種蛋中的無精蛋，跟蹤記錄每批入孵種蛋的死胎數和出雛數，并計算受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率及死胎率。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，將合格DNA置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 DNA池重測序篩選SNP 試驗前期以16只拜城油雞為試驗對象，運用DNA混池重測序技術篩選到大量SNPs，為保證后續試驗的可行性和準確性，將對篩選出的SNPs進行進一步的篩選。篩選條件如下[7]：①變異位點位于外顯子區域；②變異類型選取錯義突變；③一個基因出現多個位點變異的SNPs；④樣本基因型為雜合變異；⑤測序深度>40，測序深度越深，變異位點準確性越高。最終篩選出7個SNPs位點(表1)。

表1 FSHR基因7個SNPs相關信息

1.2.3 SNP分型 將檢測合格的DNA送至北京康普森生物技術有限公司采用Sequenom飛行時間質譜技術進行相關的位點分型。主要步驟如下：①引物設計：根據SNP位點序列信息，使用Sequenom公司的引物設計軟件Assay Design 3.1，設計PCR反應引物和單堿基擴展引物(表2)；②PCR擴增：在TaqDNA聚合酶的作用下DNA序列與引物相結合，以dNTP為反應原料、靶序列為模板對目的基因片段進行擴增；③SAP消化：將PCR混合物中所有的dNTP去磷酸化；④單堿基延伸反應：在反應體系中加入延伸引物，擴增出帶有SNP位點的PCR產物，熒光標記ddNTP，通過單堿基延伸后使引物帶上SNP位點堿基相關的熒光，反應產物經測序儀分析后得到SNP位點的信息；⑤質譜檢測：將反應產物(共9 μL)稀釋3倍，使用樹脂進行脫鹽，將脫鹽處理后的樣品點在樣品靶上，自然結晶，進行質譜檢測，并收集數據。

表2 引物信息

1.2.4 統計分析 計算7個SNPs位點的基因型頻率和基因頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡適應性檢驗及遺傳多樣性分析。試驗數據采用Excel 2010軟件初步整理，使用SPSS 26.0軟件的一般線性模型進行FSHR基因多態性與拜城油雞生產性能的相關性分析。結果以平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 基因組DNA提取

提取的基因組DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，條帶清晰明亮，無蛋白污染(圖1)。試驗樣品符合以下要求：D260 nm/D280 nm值在1.7～2.1之間；單個樣品濃度>50 ng/μL；單個樣品試驗總量>2 μg；樣品無大分子污染；樣品保持完整，無降解，可滿足后續檢測要求。

M，DNA Marker；1～16，拜城油雞樣品DNAM，DNA Marker；1-16，DNA of samples in Baicheng You chickens圖1 拜城油雞基因組DNA提取Fig.1 Genome DNA extraction of Baicheng You chickens

2.2 拜城油雞FSHR基因多態性分析

利用Mass Array技術對129個拜城油雞樣本7個SNPs進行基因分型，通過質譜軟件統計分型結果發現，7個SNPs均具有多態性，且未識別出的堿基數較少，可以進行下一步SNPs位點與生產性能遺傳效應的研究。利用Excel統計7個SNPs的等位基因頻率和基因型頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及遺傳多樣性分析，結果見表3、4。由表3可知，除SNP6外其余SNPs檢出率均在90%以上，將檢出率>90%的SNPs位點用于對拜城油雞生產性能的影響分析。χ2適應性檢驗結果顯示，除SNP2和SNP6外其余突變位點均符合Hardy-Weinberg平衡狀態。SNP1檢測到2種基因型：CC和CA，CC為優勢基因型，C為優勢等位基因；SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7均檢測到3種基因型，SNP2、SNP3和SNP7的基因型分別為：TT、TC和CC，優勢基因型均為TC，SNP2和SNP3的優勢等位基因均為T，SNP7的優勢等位基因為C；SNP4的基因型分別為AA、AG和GG，AA為優勢基因型，A為優勢等位基因；SNP5的基因型分別為CC、CG和GG，CG為優勢基因型，G為優勢等位基因；SNP6檢測到2種基因型：AA和GG，AA為優勢基因型，A為優勢等位基因。由表4可知，SNP1和SNP6均處于低度多態(PIC<0.25)，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7均處于中度多態(0.25

表3 拜城油雞FSHR基因SNPs位點的基因型頻率和基因頻率

表4 拜城油雞FSHR基因SNPs位點的遺傳多樣性

2.3 FSHR基因多態性對拜城油雞產蛋性能的影響

由表5可知，SNP2位點對開產日齡具有極顯著影響，CC基因型個體開產日齡極顯著高于TT基因型(P<0.01)，顯著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型個體開產日齡最早；SNP5位點對拜城油雞300日齡總產蛋量具有極顯著影響，對300日齡平均蛋重、開產蛋重及開產體重均具有顯著影響，其中CG基因型個體300日齡總產蛋量極顯著高于CC和GG基因型(P<0.01)，CG基因型個體300日齡平均蛋重、開產蛋重均顯著高于GG基因型(P<0.05)，CG基因型個體開產體重顯著高于CC基因型(P<0.05)；SNP7位點對拜城油雞開產蛋重有顯著影響，其中TT基因型個體開產蛋重顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)。

表5 FSHR基因SNPs對拜城油雞產蛋性狀的影響

2.4 FSHR基因多態性對拜城油雞蛋品質的影響

由表6可知，SNP2位點對拜城油雞蛋重具有顯著影響，其中TT基因型個體蛋重顯著高于CT基因型(P<0.05)；SNP3位點對拜城油雞蛋殼厚度有顯著影響，其中CC基因型個體蛋殼厚度顯著低于TT基因型(P<0.05)；SNP5位點對拜城油雞蛋殼厚度有顯著影響，其中GG基因型個體蛋殼厚度顯著低于CC和CG基因型(P<0.05)；SNP7位點對拜城油雞蛋重、蛋白高度及蛋黃重均有顯著影響，對哈氏單位有極顯著影響，其中TT基因型個體蛋重顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)，TT基因型個體蛋白高度和蛋黃重顯著高于CT基因型(P<0.05)；TT基因型個體哈氏單位極顯著高于CC和CT基因型(P<0.01)。

表6 FSHR基因SNPs對拜城油雞蛋品質的影響

2.5 FSHR基因多態性對拜城油雞孵化性能的影響

由表7可知，SNP2對拜城油雞入孵蛋死胚率有顯著影響，其中TT基因型個體入孵蛋死胎率顯著高于CC基因型(P<0.05)；其余6個SNPs不同基因型對入孵蛋孵化率、受精率和受精蛋孵化率均無顯著影響(P>0.05)。

表7 FSHR基因SNPs對拜城油雞孵化性能的影響

3 討 論

3.1 FSHR基因多態性分析

本研究結果發現，FSHR基因在拜城油雞外顯子1、4、5、10上均存在突變位點，在挑選的7個SNPs位點中，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7位點多態信息含量均為中度多態。研究發現，在遺傳多態性分析中可把有效等位基因數、遺傳雜合度和多態信息含量作為衡量某群體遺傳變異大小的指標，遺傳多態信息指標數值越大，表明遺傳變異程度越高，選擇的潛力就越大[8]。本研究中，拜城油雞試驗群體多態信息含量已達到中度多態，且該群體未偏離Hardy-Weinberg平衡狀態，說明在拜城油雞群體FSHR基因上挑選出的SNPs位點多態性相對較高，遺傳變異相對較大，有望獲得更多的遺傳進展。石宇等[9]研究發現，兔FSHR基因外顯子10中存在g.163537 G>A和g.163619 A>G突變，其中g.163537 G>A為同義突變，g.163619 A>G為錯義突變，編碼氨基酸由異亮氨酸變為纈氨酸，2個位點均處于低度多態，群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態。本研究發現，FSHR基因外顯子10中存在2個SNPs，均為錯義突變，Hardy-Weinberg平衡檢驗與石宇等[9]研究結果相似。錯義突變是指在基因序列中編碼某一種氨基酸的密碼子經堿基替換而發生改變，原本的編碼功能變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使得多肽鏈上的氨基酸種類和序列發生本質上的變化。而氨基酸作為構成蛋白的基本結構，編碼氨基酸的密碼子改變后會引起編碼的蛋白隨之變化，基因的表達又受到蛋白的調控，從而引起生物體基因的功能發生變化。錯義突變可能是一種積極的變化，自然選擇有利于基因的新表達，且生物個體可能已經從該突變開發出有利的適應，在繁殖過程中將此變化傳遞給后代[10]。

Kang等[11]研究發現，雞FSHR基因5′-UTR區存在1個200 bp長度的插入或缺失，以及cFSHR啟動子片段檢測出49個完全突變，包含39個單核苷酸替換、1個核苷酸替換和9個核苷酸的插入缺失。自先念等[12]研究發現，茶花雞FSHR基因外顯子1中發現g.34847 A>G和g.35000 C>T 2個SNPs，其中，g.34847 A>G位點只存在AA和GG 2種基因型，均屬于中度多態。本研究發現，拜城油雞FSHR基因外顯子1中存在g.7640519 C>A和g.7640639 T>C 2個SNPs，其中g.7640519 C>A位點存在2種基因型，g.7640639 T>C位點存在3種基因型，多態信息含量與自先念等[12]研究結果相似。研究發現，在人FSHR基因外顯子10上存在2個SNPs，2個SNPs位點均引起編碼氨基酸的變化[13]；豬FSHR基因外顯子10上存在3個SNPs位點，分別為：C1491T、G1885A和C1977T[14]；隴東絨山羊FSHR基因外顯子10上檢測到G1542T和T1595G 2個多態位點，其中T1595G 位點為錯義突變，可能會引起所編碼的氨基酸發生改變，此位點存在4種基因型：AA、AB、BB和AC[5]。許瑤[15]在香豬FSHR基因外顯子10中發現3個SNPs位點，即rs322800083(C/T)、rs322115220(T/C)和novel 1(G/A)，其中rs322800083(C/T)位點突變引起其編碼氨基酸由蘇氨酸變為異亮氨酸。綜上，FSHR基因在不同物種群體中均存在多態性，其中外顯子1、4和10較為重要，更具有遺傳選擇潛力。

3.2 FSHR基因多態性與拜城油雞生產性能的關聯性

FSHR基因與動物生產繁殖性能具有緊密的關聯性。研究發現，FSHR基因SNPs位點與拜城油雞產蛋性能存在顯著關聯性，與Zhang等[16]研究發現北京油雞FSHR基因存在的5個SNPs位點均與產蛋性能呈顯著相關相同，其中g.-181 A>T、g.159 C>T和g.-310 A>G位點與北京油雞不同周齡產蛋數均存在相關性，g.75470 A>G和g.75860 G>A位點對開產蛋重具有顯著影響；在東鄉雞和蘇肯雞群體中FSHR基因的SNP(C1684T)對43周齡產蛋數存在顯著影響[17]；但在拜城油雞中g.7716725 G>C位點對300日齡總產蛋量呈現極顯著影響，對開產蛋重具有顯著影響，在不同品種雞中FSHR基因影響產蛋量的位點不同。Li等[18]研究發現，FSHR基因多態性對信陽褐雞的開產日齡具有顯著影響；自先念等[12]研究發現，茶花雞FSHR基因g.35000 C→T位點的TT基因型個體開產日齡顯著高于CT基因型，CT基因型個體43周齡產蛋數顯著高于CC和TT基因型。本試驗中，FSHR基因多態性對拜城油雞開產日齡具有極顯著影響，其中g.7640639 T>C位點CC基因型個體極顯著高于TT基因型，顯著高于CT基因型。王克華等[19]研究發現，如皋黃雞FSHR基因內含子2中存在3個SNPs位點，其中C+29329A位點對開產日齡、開產蛋重及40周齡蛋重均具有顯著影響，C+30582G位點對40周齡總產蛋數具有顯著影響；G+51411A位點對開產日齡、開產體重及40周齡總產蛋數均具有顯著影響。在本研究中沒有開展FSHR基因內含子處SNPs位點與拜城油雞生產性能的關聯性分析，后續可進一步探究。李亨[20]研究表明，文昌雞FSHR基因外顯子4中存在SNPs位點，且與文昌雞300日齡產蛋數及平均聯產天數呈顯著相關；陳蘭等[21]研究發現，京海黃雞FSHR基因外顯子1和10中均存在SNPs位點，其中外顯子1突變位點對300日齡產蛋數存在顯著影響，外顯子10突變位點對開產日齡具有顯著影響。本研究中，FSHR基因外顯子1對拜城油雞開產日齡具有極顯著影響，外顯子10突變位點與300日齡產蛋量、300日齡平均蛋重及開產蛋重均具有顯著影響，與上述研究結果不同。綜上，FSHR基因多態性與雞各生產性能指標具有緊密的關聯性，但在不同品種雞中其SNPs位點存在差異，不同位點的基因型與不同品種雞生產性能的關聯結果也不同。

4 結 論

FSHR基因外顯子1、4、5和10中的SNPs位點對拜城油雞生產性能存在顯著影響，其中外顯子10中SNPs位點與拜城油雞300日齡總產蛋量存在極顯著遺傳效應，與開產日齡、開產體重等產蛋性能指標及蛋重、蛋白高度、哈氏單位等蛋品質指標均存在顯著關聯性，外顯子1中SNPs位點與拜城油雞開產日齡存在極顯著關聯性。FSHR基因外顯子處存在多態性，且與拜城油雞生產性能具有顯著關聯性，可作為與生產性能相關的分子標記基因用于拜城油雞高繁殖力種雞的選育。