香豬CHD3基因3′-側翼區264 bp結構變異的研究

黃月麗，冉雪琴，牛 熙，李 升，黃世會，王嘉福

(1.貴州大學農業生物工程研究院，山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學生命科學學院，貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽550025)

香豬屬于原始的地方豬種，主要生長于中國西南部分山區，因其雙月斷奶的仔豬宰食無乳腥味、開膛后腹腔不臭，故被稱為香豬[1]。香豬的體型矮小、短圓，在其面部形成“川”字或者菱形的褶皺紋路，普通香豬個體軀干皮膚平整，沒有褶皺，在長期養殖過程中發現少量香豬軀干和四肢皮膚呈現明顯且密布的褶皺，通過皺皮表型個體交配繁殖的仔豬中，仍然存在部分皺皮個體，說明該褶皺表型可以遺傳[2]。皮膚是動物體的第一道屏障，具有保護、體溫調節、免疫、代謝等多種生物學功能[3]，所以正常健康的皮膚顯得尤為重要。結構變異是指在基因組中存在>50 bp核苷酸序列的突變，包括缺失、易位、串聯重復、插入和倒置[4]。在生物體中大部分結構變異會導致疾病的形成。沙皮犬全身呈現非常明顯的皮膚褶皺，并且還會伴隨周期性發熱、透明質酸沉積等癥狀，經研究發現，在透明質酸合成酶2(hyaluronan synthase 2，HAS2)基因的上游存在一段核苷酸序列不穩定重復，該位點突變是導致沙皮犬出現上述現象的主要原因[5]。皺皮香豬皮膚上有大量凹凸起伏的褶皺，表皮層異常不均勻增生，皮膚中的膠原纖維和彈性纖維減少、斷裂、排列雜亂，皮膚彈性降低，并且被毛稀疏，與人類皮膚老化現象相似；皺皮香豬皮膚排泄功能受阻，凹陷處皮膚容易被寄生蟲和真菌感染，引起皮膚炎癥，同時皺皮香豬皮下脂肪層變薄，個體生長緩慢，在屠宰時被毛除不盡[6-7]。

染色質調節域解旋酶DNA結合蛋白3(chromodomain-helicase-DNA-binding protein 3，CHD3)屬于ATP依賴性染色質調節域解旋酶DNA結合蛋白(CHD)家族之一，該家族包括9個成員，分為3個亞家族，CHD3、CHD4、CHD5屬于第二亞家族(CHDII)[8]。CHD3也被稱為Mi-2α，在皮肌炎患者中作為自身抗原被發現，隨著皮肌炎的惡化，往往也會有其他并發癥出現，主要是增加典型皮疹伴壞死性肌炎和惡行腫瘤的風險[9-10]。已有研究表明，CHD3是核小體重塑與去乙酰化(nucleosome remodeling and deacetylation，NuRD)復合物的核心酶亞基[11]，該復合物利用CHD蛋白ATP水解產生的能量行使功能，廣泛參與調控基因轉錄、細胞周期、細胞發育等重要的生物學過程[12-13]。在生物體生長發育過程中，CHD3基因具有重要的作用，Snijders等[14]報道CHD3基因突變與智力殘疾、大頭畸形、語言障礙等綜合征相關；CHD3基因的突變也會導致神經發育異常、關節松弛、面部粗糙等疾病[15]；CHD3通過C-端與ETs相關分子(ETs related molecular, ERM)相互作用，調控早老素蛋白1(presenilin 1)的表達[16]。

前期研究發現，在具有全身性皺皮的香豬CHD3基因中，3′-側翼區存在一段264 bp核苷酸插入/缺失結構變異[6]，為了探究CHD3基因3′-側翼區264 bp結構變異對基因表達的影響，本試驗以普通香豬、皺皮香豬和大白豬為研究對象，采用生物信息學、實時熒光定量PCR、Western blotting等方法探究該結構變異的結構特征、遺傳多樣性以及對表達的影響，解析與香豬皺皮性狀的關系。

1 材料與方法

1.1 樣品

150頭普通香豬(XP)和30頭皺皮香豬(XPZ)皮膚組織均采自貴州大山地生態養殖有限責任公司豬場，147頭大白豬(LW)的皮膚組織采自貴州畢節市順豐養殖場。

1.2 主要試劑及儀器

血液/組織基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、Trizol試劑、反轉錄試劑盒、質粒提取試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司；pGEM-T Easy Vector購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；皮膚組織總蛋白提取試劑盒(SA-01-SK)購自萊恩生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)、極超敏ECL化學發光試劑盒(P0018FS)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0012AC)購自上海碧云天生物技術有限公司；Anti-CHD3抗體(ab134125)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(ab205718)均購自Abcam公司；內參Anti-GAPDH抗體(AF7021)購自Affinity Biosciences公司；電泳儀(DYY-6C)購自北京六一生物科技有限公司；熒光及化學發光成像系統(ChemiScope 6000)購自上海勤翔科學儀器有限公司；PCR擴增儀(T100)、定量PCR儀(CFX96)均購自Bio-Rad公司。

1.3 CHD3基因結構變異片段生物信息學分析

運用miRBase在線軟件下載豬對應的miRNA數據庫，用miRanda軟件預測CHD3基因結構變異片段所能結合的miRNA，設置結合的臨界分數(Score≥120)和自由能(Energy≤―20 kJ/mol)，分數越大，自由能越小，miRNA與mRNA結合能力越強；通過在線數據庫RBPsuite對結構變異區域的RNA結合蛋白(RBP)進行分析，分數范圍0～1，當分數>0.5時表示結合能力較強；利用UCSC Genome Browser Gateway軟件分析重復元件(TEs)。

1.4 引物設計與合成

根據GenBank中豬CHD3基因序列(登錄號：NC_010454.4)，運用Primer Premier 5.0軟件設計擴增結構變異位點的特異性引物和檢測mRNA表達量的實時熒光定量PCR引物，引物信息見表1。引物均由英濰捷(上海)貿易有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 PCR擴增及基因分型

按照DNA提取試劑盒說明書提取所采集的普通香豬、皺皮香豬、大白豬皮膚組織的基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組的完整性，檢測合格的DNA分裝后-20 ℃保存備用。

以皺皮香豬和普通香豬基因組DNA為PCR擴增模板，PCR擴增體系20 μL：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，基因組DNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 8.6 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取適量PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后由北京擎科生物科技有限公司進行核苷酸序列測定。

1.6 CHD3基因結構變異群體分布頻率檢測

以3個豬群的基因組DNA為模板，采用PCR方法對每一個樣品進行擴增，然后使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并記錄CHD3基因結構變異在3個豬群體中的存在情況；用Excel 2019計算CHD3基因結構變異基因型頻率和等位基因頻率，用SPSS 22.0軟件中的χ2檢驗分析CHD3基因結構變異是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態。

1.7 實時熒光定量PCR檢測CHD3基因表達量

根據Trizol法分別提取香豬3種基因型皮膚總RNA，反轉錄合成cDNA，以18S rRNA為內參，采用實時熒光定量PCR檢測CHD3基因表達量。PCR反應體系10 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，2×SYBR Green Supper Mix 5 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，共40個循環。熔解曲線：從65 ℃升高到95 ℃，以0.5 ℃/5 s速率上升。采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

1.8 CHD3蛋白表達量檢測

根據蛋白提取試劑盒說明分別提取香豬3種基因型皮膚總蛋白，按BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明測定蛋白濃度；進行SDS-PAGE，將蛋白帶轉移到PVDF膜上，封閉1 h，與Anti-CHD3(1∶4 000)、Anti-GAPDH(1∶4 000)在4 ℃孵育過夜，然后與HRP標記的山羊抗免IgG(1∶4 000)在常溫孵育2 h，使用極超敏ECL化學發光試劑盒檢測并拍照保存。

1.9 數據統計與分析

用ImageJ 1.8.0軟件計算蛋白條帶灰度值，用GraphPad Prism 8.0對實時熒光定量PCR和Western blotting結果進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Tukey法進行組間多重比較。結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2．1 生物信息學分析

2．1．1CHD3基因結構變異區域miRNA結合位點分析 利用miRBase和miRanda軟件預測miRNA的結合位點，結果顯示在CHD3基因結構變異片段上，分數≥120，且自由能≤-20 kJ/mol的miRNA，共35個(表2)。

表2 CHD3基因結構變異區域miRNA結合位點

續表

2.1.2CHD3基因結構變異區域RBP結合位點分析 利用RBPsuite軟件對RNA結合蛋白(RBP)進行分析，結果顯示，當分數≥0.5，共有10個RBPs能結合到CHD3基因結構變異片段上，且鋅指RNA結合域蛋白2(ZRANB2)和肉瘤融合蛋白(FUS)這2個RBPs在結構變異片段上分別有2個結合位點(表3)。

表3 CHD3基因結構變異區域RBP結合位點

續表

2.1.3CHD3基因結構變異片段的重復元件分析 利用UCSC Genome Browser Gateway軟件對CHD3基因序列進行重復元件分析，結果顯示，在CHD3基因結構變異區間存在1個254 bp的短散在元件(short interspersed element, SINE)，屬于tRNA家族，位于Chr12：53 115 742-53 115 995。

2.1.4CHD3基因結構變異分析 根據CHD3基因結構變異上的SINE元件位置和miRNA、RBP結合的位置，對其做了一個示意圖(圖1)，從圖1中可以清晰地看出擴增CHD3基因結構變異的上、下游引物位置、結構變異序列、SINE元件位置，同時還分別列舉了3個miRNA和3個RBP在結構變異序列上的結合位置，miRNA依次是miR-7137-5p、miR-676-5p、miR-9806-5p，RBP依次是RBFOX2、FXR2、IGF2BP1；箭頭所指是CHD3基因結構變異序列插入/缺失的位點(圖1)。

①波浪下劃線標出的是引物序列，灰色背景標出的是CHD3基因結構變異序列(染色體位置Chr12:53 115 726-53 115 989)，直線加粗下劃線標出的是SINE元件(染色體位置Chr12:53 115 742-53 115 995)；直角矩形框內是列舉的3個miRNAs結合位點，圓角矩形框內是列舉的3個RBPs結合位點。②箭頭所指為CHD3基因結構變異序列插入/缺失位點①Wavy underline is primer sequence, gray background is CHD3 gene structural variation sequence (chromosome position Chr12: 53 115 726-53 115 989), bold line underline is SINE element (chromosome position Chr12: 53 115 742-53 115 995); Three miRNA binding sites are listed in the rectangular box, and three RBP binding sites are listed in the rounded rectangular box. ②The arrow indicates the insertion/deletion site of structural variation sequence of CHD3 gene圖1 CHD3基因結構變異分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of structural variation analysis of CHD3 gene

2.2 CHD3基因結構變異片段的檢測

為了驗證CHD3基因結構變異是否真實存在，以普通香豬和皺皮香豬基因組DNA為PCR擴增的模板，擴增出177和441 bp 2條條帶(圖2)，將2條帶分別膠回收并進行測序，測序結果與預期大小一致；將2個條帶的DNA序列比對到豬的參考基因組(Scrofa11.1)，結果顯示與參考基因組序列相似性為99.5%。將大片段(441 bp)定義為I等位基因(插入型)，將發生缺失結構變異的片段(177 bp)定義為D等位基因(缺失型)。

①1～5，皺皮香豬；6～9，普通香豬。②M，DL2000 DNA Marker；1，DD型；4，ID型；2、3、5～9，II型①1-5, Xiang pigs with wrinkle skin; 6-9, Ordinary Xiang pigs. ②M，DL2000 DNA Marker；1，DD genotype；4，ID genotype；2, 3, 5-9，II genotype圖2 CHD3基因結構變異位點的PCR檢測Fig.2 PCR detection of CHD3 gene structural variation sites

2．3 CHD3基因結構變異群體分布頻率檢測

利用PCR的方法檢測CHD3基因的分布情況，在3個豬群體中都檢測到了3種基因型(DD型、ID型、II型)；皺皮香豬、普通香豬、大白豬的D等位基因頻率分別是30.0%、6.7%、4.8%，皺皮香豬D等位基因頻率極顯著高于普通香豬、大白豬(P<0.01)，普通香豬D等位基因頻率顯著高于大白豬(P<0.05)(表4)。

Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，CHD3基因結構變異在皺皮香豬和普通香豬中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)，在大白豬中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(P<0.05)(表4)。

表4 豬群中CHD3基因結構變異的頻率分布

2．4 CHD3基因的表達分析

實時熒光定量PCR檢測香豬皮膚中CHD3基因mRNA表達量，結果顯示DD基因型和ID基因型均極顯著高于II基因型(P<0.01)，DD基因型的mRNA表達量高于ID基因型，但是差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

**，差異極顯著(P<0.01);無*，差異不顯著(P>0.05)。下同**，Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05). The same as below圖3 不同基因型香豬CHD3基因相對表達量Fig.3 Relative expression of CHD3 gene in Xiang pigs of different genotypes

Western blotting檢測香豬皮膚中CHD3蛋白表達量，結果顯示DD基因型和ID基因型蛋白表達量均極顯著高于II基因型(P<0.01)，DD基因型蛋白表達量高于ID基因型，差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

1～3，香豬II基因型；4、5，香豬ID基因型；6～8，香豬DD基因型1-3, Genotypes II of Xiang pigs; 4 and 5, Genotypes ID of Xiang pigs; 6-8, Genotypes DD of Xiang pigs圖4 不同基因型香豬CHD3蛋白表達水平Fig.4 Expression of CHD3 protein in Xiang pigs of different genotypes

3 討 論

CHD3蛋白是皮肌炎患者中的自身抗原，皮肌炎主要表現為皮膚損傷和肌肉無力。有研究證明，在皮肌炎患者中，基質金屬蛋白酶(MMP)表達水平上調，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)被大量降解[17]，細胞外基質的主要成分包括膠原蛋白和彈性蛋白，它們的主要作用是維持皮膚、器官、組織的形狀，使其不易變形，皮膚中ECM的減少是皺紋形成的重要原因[18]。研究發現，CHD4通過調控纖溶酶的活性，對ECM的水解產生影響[19]，CHD3和CHD4的結構和氨基酸序列高度相似[20]，推測具有相似的調控功能。核小體重塑和脫乙酰酶(NuRD)復合物是細胞中發現的主要染色質重塑復合物之一，它在調節基因轉錄、基因組完整性和細胞周期進程中起著重要作用，通過其對這些基本細胞過程的影響，越來越多的證據表明，這種大分子復合物活性的改變可導致發育缺陷、癌癥和加速衰老[21-23]。NuRD含有多種組分，包括CHD3(或CHD4)以及HDAC1/2、MTA2/3和MBD2/3等多種阻遏因子，CHD3、CHD4是NuRD復合體的活性亞單位(核小體重塑和脫乙酰酶活性)，這些蛋白質形成不同的CHD3和CHD4-NuRD復合物，它們不僅能抑制特定靶基因的基因轉錄，還可以激活特定靶基因的基因轉錄[20]。之前的研究表明，在香豬中CHD3基因的3′-側翼區具有一段264 bp核苷酸插入/缺失結構變異[6]。為了證實豬群體中存在的這一結構變異，檢測了2個豬品種3個群體中264 bp結構變異的基因型，包括普通香豬、皺皮香豬和大白豬。結果表明，CHD3基因的264 bp結構變異多態性在香豬和大白豬中普遍存在，并且在皺皮香豬、普通香豬、大白豬中的基因型頻率不同。I等位基因頻率為大白豬>普通香豬>皺皮香豬，而D等位基因頻率是皺皮香豬>普通香豬>大白豬。CHD3基因3′-端264 bp結構變異在皺皮香豬和普通香豬中處于Hardy-Weinberg平衡狀態，在大白豬中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態，表明這一結構變異在香豬群體中是隨機變異，而大白豬中不是隨機的，而是高度人工選擇的結果。

生物信息學分析顯示，CHD3基因264 bp插入/缺失結構變異位于該基因的3′-側翼區(mRNA的3′-UTR)，屬于tRNA家族的SINE元件，該元件序列含有35個miRNAs結合位點、10個RBPs結合位點。SINE是由RNA聚合酶Ⅲ轉錄的真核非自主逆轉錄轉座子[24]，并可逆轉錄成DNA插入基因組中的新位點，約占哺乳動物基因組的10%，因此，它們在基因組的結構組織、生物過程的協調乃至物種的多樣性和進化中發揮著關鍵作用[25]。SINE可以影響mRNA從細胞核的輸出、mRNA翻譯以及mRNA的衰變[26]；當SINE在3′-UTR中存在時，它可以通過Staufen蛋白介導mRNA衰變，從而使mRNA降解[27]，Staufen蛋白屬于雙鏈RNA結合蛋白家族，有2個同源蛋白，即Staufen1和Staufen2，Staufen2可以與mRNA的3′-UTR區結合，誘導mRNA降解[28]。miRNA是基因轉錄后表達調控的重要分子，通常與mRNA的3′-UTR區結合來抑制mRNA翻譯或者促使mRNA降解[29]。本研究結果顯示，CHD3基因中D等位基因的存在導致該基因表達增強，蛋白豐度增加，I等位基因的表達低于D等位基因，推測I等位基因由于SINE元件的存在，通過RNA結合蛋白調節CHD3基因的mRNA穩定性，誘導mRNA降解，而miRNA進一步抑制CHD3基因的mRNA翻譯，從而導致含有SINE元件的CHD3基因的mRNA和蛋白表達均低于缺失SINE元件的CHD3基因。由于D等位基因缺失SINE元件，miRNA和RBP失去了對基因表達調控的功能，使CHD3基因表達上調。

在ATM介導的DNA損傷修復研究中發現，CHD3蛋白的一個亞型CHD3.1通過其C-端與KAP-1相互作用維持染色質壓縮狀態[30-31]，阻礙DNA損傷修復，通過ATM依賴性KAP-1磷酸化后(pS824-KAP-1)，消除了CHD3和KAP-1的相互作用，CHD3蛋白從染色質上釋放，異染色質逐漸松弛，損傷修復才得以進行[32]。同時，在ATM-KAP-1信號通路介導的染色質修復過程中CHD3具有一定的阻礙作用[33]。在小鼠早衰模型研究中，當ATM-KAP-1信號通路異常，會導致小鼠胚胎成纖維細胞的衰老，加速小鼠的早衰[34-35]。由以上推測CHD3基因的異常表達可能會間接導致動物衰老。本研究發現，香豬皮膚組織中，CHD3基因和蛋白的表達量均為DD基因型>ID基因型>II基因型，表明該結構變異促使CHD3基因表達量上調，該基因的表達上調可能會導致NuRD功能或者ATM-KAP-1信號通路的異常，影響相關靶基因的乙酰化水平，阻礙損傷位點修復和染色質重塑，從而誘導細胞凋亡，加速細胞的衰老。同時等位基因頻率結果顯示，皺皮香豬中CHD3基因結構變異D等位基因頻率極顯著高于普通香豬和大白豬。由以上論述推測CHD3基因結構變異可能與香豬皺皮形成有關。

4 結 論

豬CHD3基因的3′-側翼區264 bp插入/缺失結構變異在香豬和大白豬中呈現多態性，皺皮香豬的D等位基因頻率大于普通香豬和大白豬，該結構變異屬于tRNA家族的SINE元件，含35個miRNAs和10個RBPs結合位點，參與CHD3基因的表達調控，皺皮香豬CHD3基因中該元件的缺失，導致CHD3基因的異常表達和積累，可能是香豬皺皮形成的重要因素之一。