不同腹脂率番鴨回腸轉錄組差異分析

王小驪，王興鑫,，楊彩梅，肖英平，楊 華，呂文濤

(1.浙江省農業科學院，省部共建農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，杭州 310021；2.浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，杭州 310021；3.浙江農林大學動物科技學院·動物醫學院，杭州 311300)

番鴨原產于南美洲與中美洲熱帶地區，具有肉質好、脂肪少、瘦肉多、蛋白質含量高等特點。脂肪是畜禽體內重要的能量來源和能量貯備形式，但脂質氧化將影響其氣味和風味，引起肉品質和營養價值急劇下降[1]，但對家禽而言，超過85%的胴體脂肪是多余的并非生理需要，而腹部是脂肪的主要沉積部位[2]。過多的腹脂沉積不僅會造成飼料的浪費[3]，還會影響屠宰率[4]。脂肪沉積受到脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)和血管生成素樣蛋白(angiopoietin-like proteins，ANGPTLs)等影響。研究發現，FAS的催化是脂肪酸合成中的最后一步，在脂肪代謝中起關鍵作用[5]。Semenkovich[6]研究表明，FAS可以通過提高甘油三酯的合成，促進動物脂肪的沉積。豐勝求[7]研究發現，Angptl1和Angptl2基因均在豬的脂肪組織中高表達。Angptl3、Angptl4、Angptl8也被證實與抑制脂肪代謝有關[8]。此外，脂肪酸結合蛋白家族(fatty acid-binding protein,FABPs)在脂肪代謝與沉積方面也起著重要作用。FABPs是一類小分子細胞內蛋白質，與細胞內脂肪酸運輸有關，參與宿主體內脂肪的合成與降解[9]。王起貴[10]研究發現，雞肝臟型-FABP(L-FABP)基因的5′-側翼區2個多態性位點G204A和T205C與雞的腹脂重和腹脂率有顯著相關性。microRNA(miRNA)是動物體內常見的基因表達因子。通過對不同高、低腹脂含量的母雞腹脂的miRNA表達檢測及miRNA-mRNA相互作用分析發現，差異表達的miRNA包括miR-30d、miR-26a和miR-17-5p等[11]。Chen等[12]發現miR-30d與miR-30a-5p、miR-146b5p、miR-21和miR-101-3p在雞腹部脂肪組織中大量表達，并在脂肪形成調控中發揮作用。目前對雞的脂肪代謝方面的研究較多，但對鴨的脂肪代謝相關基因的研究比較缺乏。小腸是機體消化和吸收營養物質最重要的場所，其中位于小腸后段的回腸，在脂肪吸收的過程中發揮著作用[13-14]。因此，本試驗利用轉錄組測序技術對高、低腹脂率的番鴨回腸進行測序分析，篩選與番鴨脂肪代謝相關的通路和基因，為進一步研究脂肪代謝途徑的分子調控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物和組織樣品采集 本試驗選用2 000只1日齡雄性商代種番鴨，初體重為(38.46±0.87)g，試驗地點在浙江省蘭溪禾旺禽業合作社，番鴨自由采食和飲水，飼糧組成與楊華等[15]試驗一致。飼養70 d后，隨機選取200只體況健康的番鴨屠宰后稱重，采集每只番鴨的腹部脂肪并稱重，同時采集所有番鴨的回腸組織，迅速置于液氮中速凍，于-80 ℃保存，以備提取樣品總RNA。根據禽肉行業標準(NY/T 753—2003)，計算腹脂率，將200只平均腹脂率為2.58%±0.73%的番鴨，按照腹脂率排序，取腹脂率最高的5只為H組，最低的5只為L組，對其回腸組織進行轉錄組分析。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRIzol?Plus RNA純化試劑盒和反轉錄試劑盒PrimeScript RT MasterMix(Perfect Real-time)均購自Invitrogen公司；RNase-free DNase Set試劑盒購自Qiagen公司；RNA Nano6000檢測試劑盒購自安捷倫公司；NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit和熒光定量染料試劑盒Power SYBR?Green Master Mix購自Applied Biosystems公司。

Nanohotometer?分光光度計購自IMPLEN公司；NanoDrop分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與質量檢測 從回腸組織中提取總RNA，使用TRIzol?Plus RNA純化試劑盒進行純化，并按照說明書使用RNase-free DNase Set對總RNA進行處理。使用Nanohotometer?分光光度計檢測RNA的純度，使用NanoDrop分光光度計檢測RNA的濃度，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性和污染程度，使用安捷倫生物分析儀2100系統的RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA樣本的完整性。

1.2.2 文庫構建與質檢 建庫起始RNA為總RNA，總量≥1 μg。使用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit建庫試劑盒建立文庫。通過Oligo(dT)磁珠富集帶有Poly A尾的mRNA，隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷。以片段化的mRNA為模板，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA Polymerase Ⅰ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得文庫。

文庫構建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后，采用實時熒光定量PCR對文庫有效濃度進行準確定量，文庫有效濃度的最低閾值為2 nmol/L，以保證文庫質量。

1.2.3 上機測序 庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求篩選后，在Illumina平臺上測序產生150 bp配對末端讀數。測序的基本原理是邊合成邊測序(sequencing by synthesis)。在測序的流通通道中加入4種熒光標記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。

1.3 數據處理和生物信息學分析

1.3.1 參考序列比對 對過濾后的數據進行Trinity拼接處理，將Trinity拼接得到的轉錄組作為參考序列(Ref)，采用RSEM軟件將每個樣品的高質量數據(clean reads)與Ref進行比對，分別過濾掉比對質量值低于10的reads，非成對比對上的reads，比對到基因組多個區域的reads。

1.3.2 差異基因表達分析 使用DESeq R包(1.10.1)進行H和L組的差異表達分析。DESeq提供統計程序，使用基于負二項分布的模型確定數字基因表達數據中的差異表達。使用Benjamini和Hochberg方法調整得到的P值以控制錯誤發現率。由DESeq篩選出P<0.05的基因被指定為差異表達基因。

1.3.3 GO和KEGG富集分析 采用GOseq(1.46.0)和KOBAS(KOBAS 3.0)軟件對差異基因集進行GO(gene ontology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

1.3.4 實時熒光定量PCR分析 利用實時熒光定量PCR驗證番鴨回腸基因文庫中RNA-Seq基因表達數據的準確性和重復性。分別提取高、低腹脂率組番鴨回腸的總RNA，利用反轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒進行cDNA合成和基因定量檢測，引物采用NCBI網站上的Primer-BLAST程序(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)進行設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。實時熒光定量PCR反應體系20 μL:Power SYBR?Green Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，共40個循環；55～95 ℃繪制熔解曲線。每個樣品重復3次，各個基因的相對表達水平以2-ΔΔCt法進行計算。

表1 引物信息

1.4 數據分析

采用SPPS 20.0中的非配對t檢驗進行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，結果以平均值±標準差表示，以P<0.05和P<0.01作為差異顯著性判斷標準。采用R軟件包進行皮爾森相關性分析。

2 結 果

2.1 腹脂與腹脂率

由表2可知，H與L組的體重差異均不顯著(P>0.05),H組的腹脂重和腹脂率均極顯著高于L組(P<0.01)。

表2 各組體重、腹脂重與腹脂率

2.2 RNA測序結果

10個樣本中原始數據的平均值為52 472 860 bp，對原始數據進行質控處理后平均每個樣本有51 479 286個高質量數據，占原始數據的98.11%。Q30平均值為91.30%。將Trinity拼接得到的轉錄組作為Ref，高質量數據映射到Ref的平均映射率為80.11%(表3)。

表3 番鴨回腸轉錄組的序列質量和比對信息

2.3 差異表達基因分析

兩組樣品中共檢測到31 517個基因，以P<0.05和log2|FoldChange|>1為閾值，共鑒定出602個差異表達基因，其中包括285個上調基因和317個下調基因(圖1)。根據每個樣本差異表達基因表達水平的log2(倍數變化)值進行聚類分析，兩組樣品都顯示出了良好的重復性(圖2)。

①豎線是差異閾值的2倍，橫線是P=0.05閾值。②A象限的點表示下調基因，B象限的點表示上調基因，其余的點表示非差異表達基因①The vertical line is twice the difference threshold,and the horizontal line is the P=0.05 threshold. ②The dots in quadrant A represent down-regulated genes,those in quadrant B represent up-regulated genes,and the remaining dots represent non-differentially expressed genes圖1 H和L組差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes in H and L groups

①色標表示RPKM歸一化的log2轉換計數。②單杠代表基因；垂直欄代表樣品。③顏色較深表示較高表達的基因，顏色較淺表示較低表達的基因①The color scale represents the log2 conversion count normalized by RPKM. ②The horizontal bar represents genes;The vertical bars represent samples. ③Darker colors indicate genes with higher expression,and lighter colors indicate genes with lower expression圖2 差異表達基因的聚類熱圖分析Fig.2 Clustering heat map analysis of differentially expressed genes

2.4 差異表達基因的功能富集分析

對602個差異表達基因進行了GO功能富集分析，包括生物過程、細胞成分和分子功能三大類，共有73個通路顯著富集(P<0.05)，篩選出5個與脂質代謝相關的條目：脂質應答(response to lipid)、類固醇激素介導的信號通路(steroid hormone mediated signaling pathway)、類固醇激素應答(response to steroid hormone)、類固醇激素刺激的細胞應答(cellular response to steroid hormone stimulus)和脂質的細胞應答(cellular response to lipid)，而且富集到這5個條目的差異表達基因是相同的(表4)。

表4 與脂質代謝相關的GO條目

進一步對602個差異表達基因進行KEGG通路分析，共有16個通路顯著表達(P<0.05，圖3)。其中PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、初級膽汁酸的生物合成(primary bile acid biosynthesis)、膽汁分泌(bile secretion)和花生四烯酸代謝通路(arachidonic acid metabolism)與脂肪代謝沉積相關(表5)。

Renin-angiotensin system，腎素-血管緊張素系統；Drug metabolism-other enzymes，藥物代謝-其他酶；Pentose and glucuronate interconversions，戊糖和葡萄糖酸酯的相互轉化；Histidine metabolism，組氨酸代謝；PPAR signaling pathway，PPAR信號通路；Glutathione metabolism，谷胱甘肽代謝；Chemical carcinogenesis，化學致癌作用；Primary bile acid biosynthesis，初級膽汁酸的生物合成；Pyrimidine metabolism，嘧啶代謝；Taurine and hypotaurine metabolism，牛磺酸和低牛磺酸代謝；Type Ⅱ diabetes mellitus，Ⅱ型糖尿??；Arachidonic acid metabolism，花生四烯酸代謝；Protein digestion and absorption，蛋白質消化吸收；Bile secretion，膽汁分泌；Ascorbate and aldarate metabolism，抗壞血酸和醛酸代謝；Cytokine-cytokine receptor interaction，細胞因子細胞因子受體相互作用圖3 差異表達基因KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

表5 與脂肪代謝相關的KEGG通路

2.5 實時熒光定量PCR 驗證

為了驗證RNA-Seq結果的準確性，共挑選了5個差異表達基因(ACBP、FABP2、FABP4、FABP5和ACOX2基因)進行實時熒光定量PCR分析。如圖4所示，H組這5個基因相對表達量均高于L組，但差異均不顯著(P>0.05)，與RNA-Seq結果一致。

2.6 相關性分析

通過對番鴨腹脂重和腹脂率與篩選出的基因進行皮爾森相關性分析發現，腹脂重和腹脂率與NR5A2、ACBP、ACOX2、FABP2、FABP4和FABP5基因均呈正相關(r=0.47～0.87)。其中，ACOX2和FABP5基因與腹脂重和腹脂率呈顯著正相關(P<0.05)，ACBP基因與腹脂重和腹脂率呈極顯著正相關(P<0.01)(圖5)。

圖4 實時熒光定量PCR驗證Fig.4 Validation of Real-time PCR

*，顯著相關(P<0.05)；**，極顯著相關(P<0.01)*，Significant correlation (P<0.05)；**，Extremely significant correlation (P<0.01)圖5 腹脂重和腹脂率與差異表達基因的相關性分析Fig.5 The correlation analysis of abdominal fat weight and abdominal fat rate with differentially expressed genes

3 討 論

家禽胴體脂肪含量過高會對其生產性能造成一定的影響，特別是肉用型家禽[16]。與肌內脂肪不同，腹脂不能增加肉的風味和口感，過高的腹脂含量只會造成飼料的浪費[17]，因此如何調控番鴨的腹脂含量成為了一個亟待解決的問題。腹脂的形成與脂肪的代謝和沉積有很大的關系，可以通過調控脂肪的代謝和沉積來影響腹脂的生成。脂肪是體內重要的能量來源和能量貯備形式，在體內的能量動態平衡中發揮著重要作用[18]。家禽脂肪細胞的自身合成能力有限，其脂肪來源主要是肝臟的合成以及腸道外源脂肪的吸收[19]。動物采食后，其中的脂類分子會被腸道吸收，經門脈系統被運送至血液，儲存于脂肪組織中(如腹脂)[20]。因此，本試驗對番鴨的回腸組織進行轉錄組分析，共篩選出602個差異表達基因。通過GO功能和KEGG富集分析，篩選出與脂肪代謝相關的5個GO通路、4個KEGG通路和6個基因(NR5A2、ACBP、ACOX2、FABP2、FABP4和FABP5基因)。

GO富集分析發現，脂質應答、類固醇激素介導的信號通路、類固醇激素應答、類固醇激素刺激的細胞應答和脂質的細胞應答5個條目與脂肪代謝相關，其中5個條目富集的基因是相同的，只有NR5A2基因參與了脂肪的代謝，其他基因與脂肪代謝之間的關系尚不明確。核受體通過調節參與膽汁酸合成、膽固醇穩態和甘油三酯合成的基因的表達，是一個關鍵的代謝傳感器[21]。與氧化甾醇受體NR1H3/LXR-alpha和NR1H2/LXR-beta一起，是脂質代謝的重要轉錄調節因子[22]。

KEGG富集分析發現，有4個與脂肪代謝相關的通路：PPAR信號通路、初級膽汁酸的生物合成、花生四烯酸代謝和膽汁分泌。PPAR信號通路主要參與調控脂肪酸代謝、糖代謝、細胞增殖與分化等[23]。FABP2、FABP4、FABP5、ACBP和ACOX2等與脂肪代謝相關的基因在此通路富集表達。FABP4是脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding proteins，FABPs)家族中的一員，對機體的脂質代謝有重要的調控作用，一方面它能促進血液內的脂肪酸向細胞膜流動；另一方面又能通過結合脂肪酸來調控脂類代謝相關基因的表達[24]。該基因在H組得到上調，說明其在H組中得到較高的表達。同屬于脂肪酸結合蛋白家族的FABP2和FABP5也在H組上調表達。其中FABP2主要存在于小腸細胞中，但在回腸中表達最高，參與了從腸腔中吸收脂肪酸的過程，負責長鏈脂肪酸的吸收、運輸與代謝[25-26]。研究表明，FABP5通過影響脂質代謝從而發揮信號轉導作用，廣泛參與攝取和運輸長鏈脂肪酸，基因調控、細胞生長和分化[27]。研究表明，ACBP可以刺激食欲，與人的肥胖也息息相關[28]。此外，研究結果表明，胞質外的ACBP在調節攝食行為以及葡萄糖和脂質代謝過程中起關鍵作用[29]。在本試驗中發現該基因在H組的表達高于L組，與上述研究結果一致。ACOX2基因在H組上調表達，其參與脂肪酸代謝、脂蛋白代謝和膽汁酸合成以及過氧化物脂類代謝，在脂肪酸代謝途徑中高表達，是脂肪酸代謝過程中重要的調控基因[30]。ACOX2基因又被稱作過氧化物酶支鏈酰輔酶A氧化酶2，在過氧化物酶體中，該基因作為一種限速酶，在支鏈脂肪酸β氧化過程中催化不飽和脂肪酸氧化，將長鏈脂肪酸氧化生成短鏈脂肪酸[31]。此外，該基因還會催化膽固醇形成膽汁酸，而后者可以通過影響葡萄糖代謝以及脂質和能量的消耗,從而調控組織內脂肪酸的含量[32]。

4 結 論

本試驗通過對高、低腹脂率番鴨回腸進行轉錄組測序分析，發現共有602個差異表達基因，其中包括285個上調基因和317個下調基因。差異基因主要富集于5個與脂肪代謝相關的GO通路(脂質應答、類固醇激素介導的信號通路、類固醇激素應答、類固醇激素刺激的細胞應答和脂質的細胞應答)和4個KEGG通路(PPAR信號通路、初級膽汁酸的生物合成、花生四烯酸代謝和膽汁分泌)。此外，篩選出了6個與脂肪代謝顯著相關的基因：NR5A2、ACBP、ACOX2、FABP2、FABP4和FABP5，其中，ACOX2和FABP5與腹脂重和腹脂率呈顯著正相關，ACBP與腹脂重和腹脂率呈極顯著正相關。此研究填補了番鴨回腸組織中調控脂肪代謝沉積基因的空白，為后續腹脂沉積的調控提供了理論基礎。