利用單堿基編輯器定點突變豬肌肉生長抑制素基因的研究

王 晶，朱 喆，張 鵬，畢延震

(1.中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；2.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程與分子育種湖北重點實驗室，武漢 430064)

中國豬種質資源豐富，占全世界1/3左右。寧鄉(xiāng)花豬是中國本土著名品種，具有肌內脂肪含量高、繁殖力高、抗病抗逆性強等優(yōu)勢，但其生長速度、飼料報酬和瘦肉率低等缺點限制了該品種在市場中的發(fā)展。因此，如何在規(guī)避缺點的同時最大化利用其內在優(yōu)勢，對寧鄉(xiāng)花豬乃至整個地方豬養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展有著重要意義。

傳統(tǒng)豬遺傳育種周期長且成本高。目前，以CRISPR/Cas9技術為基礎的基因編輯技術已經廣泛應用于一個或多個優(yōu)良性狀的研究，該方法在豬種質資源創(chuàng)新中具有重要意義[1-2]。在CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中，sgRNA與Cas9蛋白形成的復合物會切割靶DNA，導致靶DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)，DSB是最嚴重的DNA損傷形式之一，可能會引起染色體結構異常或缺失，擾亂細胞正常功能，最終導致細胞死亡[3-4]。因此，如何能在不產生DSB的情況下進行精準編輯成為亟需解決的難題。2016年，以CRISPR/Cas9為基礎的單堿基編輯技術應運而生，該技術在不造成DSB的情況下精準突變單個堿基，其原理是將失去切割活性的核酸酶Cas9蛋白(deactiaved Cas9，dCas9)和作用于單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)堿基的脫氨酶融合，依靠sgRNA將堿基編輯酶錨定到靶位點上，從而使局部ssDNA上的胞嘧啶(cytosine，C)或腺嘌呤(adenine，A)脫氨，實現(xiàn)精準C→T或A→G替換[5],其中，胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor，CBE)可以將密碼子(CAA、CAG、CGA或TGG)精準轉換成終止密碼子(TAG、TAA或TGA)來阻止翻譯[6]。與傳統(tǒng)CRISPR/Cas9技術相比，單堿基編輯器能在避免發(fā)生DSB及堿基缺失或增加的情況下實現(xiàn)基因突變，減少DNA損傷和細胞死亡[5]。近年來，科學家致力于改進堿基編輯器，已經產生了具有高編輯效率[7]、窄編輯窗口和廣泛前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)識別位點的多種變體[8]，且應用于多種動物基因編輯[9-11]。

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)又稱生長分化因子8，主要在骨骼肌中表達，對肌肉發(fā)育和再生具有負調控作用[12]。MSTN基因自然突變會使牛表現(xiàn)出“雙肌”性狀[12]，而寧鄉(xiāng)花豬在自然情況下不存在MSTN基因有益突變。研究發(fā)現(xiàn)，人為敲除MSTN基因會導致豬背膘厚度下降，脂肪含量減少[13]，證明了運用基因編輯的方法進行遺傳改良是有效的。因此，本研究利用單堿基編輯技術編輯寧鄉(xiāng)花豬的MSTN基因，利用CBE在基因編碼區(qū)定向引入終止密碼子，建立基因敲除的單堿基編輯體系，為培育MSTN堿基編輯豬奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

寧鄉(xiāng)花豬來源于湖南楚溈香農牧股份有限公司保種場。單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS由中國農業(yè)科學院贈送。pMLM3636-puro由湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所合成保存；DNA Ladder和Premix酶均購自TaKaRa公司；限制性內切酶購自Thermo Scientific公司；嘌呤霉素由Biosharp提供；DMEM和DPBS均購自HyClone公司；血清購自Invigentech公司。

1.2 方法

1.2.1 寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細胞的培養(yǎng) 取7日齡寧鄉(xiāng)花豬，用靜脈注射法致死，75%乙醇溶液消毒全身，酒精棉球擦拭腹部后，用手術刀割開豬腹部，取出腎組織，用生理鹽水清洗5～6次，再用含1%雙抗(青霉素和鏈霉素混合溶液)的DPBS清洗，將組織放入培養(yǎng)皿中，剪去表面膜，將腎組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用槍頭吸取將組織塊均勻鋪在6孔板中。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱倒置1 h后，加入2 mL完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%雙抗)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換一次液，5～7 d后去除組織塊。

1.2.2 sgRNA及檢測引物設計 在寧鄉(xiāng)花豬MSTN基因第2外顯子(Chromosome 15，GeneID:399534)處設計sgRNA。sgRNA的設計滿足以下條件：①sgRNA的長度為20 bp，PAM序列為NGG；②遠離PAM位點的4—8 bp處，正義鏈需要有C，反義鏈需要有G；③轉變后的堿基(C→T或G→A)與相鄰堿基可以將原有氨基酸轉變成終止密碼子(TAA、TAG、TGA)；④sgRNA的GC含量在40%～60%之間。以此為基礎，設計sgRNA(表1)，并在正義鏈的5′-端添加ACACC酶切位點，反義鏈5′-端添加AAAAC保護堿基。根據MSTN基因序列，運用Primer Premier 3.0軟件設計MSTN基因擴增序列引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3 sgRNA表達載體構建 將sgRNA插入多克隆位點5′-BsmBI-3′之間，pMLM3636-puro質粒經內切酶BsmBⅠ酶切后，用膠回收試劑盒回收切割成功的酶切產物。將合成的sgRNA稀釋成10 μmol/L后退火形成雙鏈，反應體系20 μL：sgRNA-F 1 μL，sgRNA-R 1 μL，10×NEB Buffer 2 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應條件為：95 ℃，5 min；37 ℃，1 h；4 ℃保存。將線性化的pMLM3636-puro載體與雙鏈sgRNA連接，反應體系10 μL：線性化pMLM3636-puro 1 μL，sgRNA 3 μL，Solution Ⅰ 5 μL，ddH2O補足至10 μL。置于37 ℃恒溫水浴鍋中連接5 h，構建PMLM3636-puro-MSTN;將連接好的載體轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，活化后均勻涂布在含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)皿上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，搖菌后將菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證；利用無內毒素質粒小提中量試劑盒提取質粒，通過凝膠電泳判斷pMLM3636-puro和pMLM3636-puro-MSTN大小。

1.2.4 電轉液配制 配制10×電轉液：KCl 4.473 g，CaCl20.0083425 g，Hepes 2.9787 g，EDTA 0.37224 g，無水MgCl20.238 g，K2HPO41.14 g，調節(jié)pH為7.6，加ddH2O定容至50 mL，于4 ℃保存。使用前用ddH2O稀釋為1×電轉液，0.22 μm濾器過濾，分裝后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 電轉染寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細胞 將寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細胞復蘇并置于6孔板中培養(yǎng)，當細胞匯合度達到90%時，用0.25%胰酶消化細胞，1 min后，加入適量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打細胞，至細胞分散，收集細胞至1.5 mL離心管中；1 000 r/min離心2 min，棄去上清液，依次用DPBS和電轉液吹打洗滌，離心后棄去上清液，將提前準備好的質粒(YE1-BE3-FNLS：6 μg，pMLM3636-puro-MSTN：3 μg)、細胞沉淀和電轉液共100 μL轉入電轉杯中，電轉條件：220 V，3 ms，1 pulse；電轉完成后將電轉杯中的液體全部吸取接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，同時加入嘌呤霉素進行藥篩，并觀察熒光表達情況。利用Image J軟件計算不同視野下帶有紅色熒光的細胞占該視野下所有細胞的比例，并計算轉染效率(整體平均值)。

1.2.6 單克隆細胞挑取和Sanger測序分析 藥篩72 h后，更換新鮮含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每3 d換一次液，培養(yǎng)7 d后，挑取單克隆細胞至48孔板，待48孔板長滿后，傳代至24孔板，分別取200 μL單克隆細胞和野生型細胞懸液，用細胞裂解液裂解后直接作為PCR模板，使用檢測引物擴增。PCR反應體系25 μL：2×PremixTaq12.5 μL，DNA模板 1 μL，MSTN-F 1 μL，MSTN-R 1 μL，補充ddH2O至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將鑒定正確的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.7 Western blotting檢測MSTN蛋白的表達情況 將野生型細胞和陽性單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)，收集細胞，離心后加入蛋白裂解液，冰浴30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。測定蛋白濃度后按比例加入適量SDS和RIPA混勻，95 ℃ 10 min，蛋白變性后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?20 V、1.5 h條件下進行SDS-PAGE分離蛋白，聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%，電泳后將蛋白轉移至PVDF固態(tài)膜上，再經5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后滴加顯色液后顯影。采用Image J軟件對Western blotting結果進行量化分析，以β-tubulin作為內參對照。試驗數據用GraphPad Prism 9.0進行統(tǒng)計學分析，結果以平均值±標準差表示，采用t檢驗分析差異顯著性，以P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細胞的培養(yǎng)

采用組織貼壁法分離寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細胞。培養(yǎng)3 d后可以明顯觀察組織塊周圍有細胞生長，細胞以紡錘形為主，形態(tài)不均一，生長旺盛，培養(yǎng)7 d后，除去組織塊，將剩余細胞傳代至6孔板中，2 d后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，細胞呈現(xiàn)梭形，邊緣清晰，形態(tài)均一，生長力旺盛(圖1)，說明成功分離獲得寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細胞。

A，原代培養(yǎng)；B，F(xiàn)2傳代培養(yǎng)A，Primary culture;B，F(xiàn)2 subculture圖1 寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細胞形態(tài)(100×)Fig.1 Morphology of kidney fibroblasts in Ningxiang pig (100×)

2.2 構建sgRNA表達載體并轉染寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細胞

測序結果顯示，pMLM3636-puro-MSTN質粒構建成功(圖2)。采用電轉染的方法將單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS和重組表達載體pMLM3636-puro-MSTN共轉染至腎成纖維細胞，24 h后觀察紅色熒光表達情況(圖3)，利用Image J軟件計算轉染效率為67.4%。

2.3 陽性單克隆細胞篩選和基因靶位點測序結果分析

對挑取至24孔板中培養(yǎng)的單克隆細胞進行PCR鑒定。結果顯示，MSTN基因PCR擴增產物大小為346 bp(圖4A)。Sanger測序結果表明，55個單克隆細胞中，有3個陽性單克隆細胞在目標位點發(fā)生突變，目標位點突變率為5.5%(3/55)(圖4A)，其中僅10號陽性單克隆細胞在目標位點附近無脫靶現(xiàn)象。另外，有9個在非目標位點發(fā)生突變，非目標位點突變率為16.4%(9/55)(圖4B)，其中非目標突變位點在第3位，并不在傳統(tǒng)的堿基編輯窗口(4—8 bp)之內。

2.4 Western blotting檢測MSTN蛋白的表達

為進一步確定MSTN基因敲除的可靠性，選擇僅含目標突變的10號陽性單克隆細胞進行Western blotting檢測。由圖5可知，以β-tubulin為內參，與野生型相比，試驗組10號單克隆細胞MSTN蛋白表達量下降約60%。說明在MSTN第2外顯子產生的終止密碼子能夠有效降低MSTN蛋白水平。

M，15000 bp DNA Marker；1，pMLM3636-puro；2，pMLM3636-puro-MSTN圖2 pMLM3636-puro-MSTN質粒的電泳圖(A)和測序峰圖(B)Fig.2 Electropherogram (A) and sequencing map (B) of pMLM3636-puro-MSTN plasmid

圖3 電轉染24 h后紅色熒光表達情況(100×)Fig.3 Expression of red fluorescence after electransfection for 24 h (100×)

①A，目標突變單克隆細胞電泳圖和測序峰圖；B，非目標突變單克隆細胞測序峰圖。②M，100 bp DNA Ladder；WT，野生型；數字10、25、51、3、6、7、9、15、20和36，突變單克隆細胞編號①A，Electrophoretogram and sequencing map of target mutant monoclonal cells；B,Sequencing map of non-target mutant monoclonal cells.②M，100 bp DNA Ladder；WT，Wild type；Numbers 10,25,51,3,6,7,9,15,20 and 36，The mutant monoclonal cell number,respectively圖4 靶位點測序峰圖Fig.4 Sequencing map of target sites

①WT，野生型；10，10號單克隆細胞。②**，差異極顯著(P<0.01)①WT，Wild type;10，No.10 single clone.②**，Extremely significant difference (P<0.01)圖5 Western blotting檢測MSTN蛋白表達量Fig.5 MSTN protein expression levels detected by Western blotting

3 討 論

CRISPR/Cas9基因編輯技術目前已被廣泛應用于畜禽的改良育種方面，但該技術也面臨著一些問題，Cas9蛋白可以在不依賴sgRNA的情況下突變基因組，引起DSB的產生，導致基因組不穩(wěn)定；其次，CRISPR/Cas9技術導致DSB而誘發(fā)的同源重組修復途徑需要同源模板的參與才能實現(xiàn)堿基的精準替換，而如何選擇供體模板形式和遞送方式是目前存在的難題[14]。2016年，Komor等[5]利用dCas9蛋白，結合脫氨酶開發(fā)了單堿基編輯器，該工具能在避免雙鏈DNA斷裂且無需供體DNA的情況下實現(xiàn)對基因組DNA進行精確的點突變，具有更高的精確度和安全性。

本研究使用單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS在MSTN基因第2外顯子上人為引入終止密碼子。目標位點G(C)→A(T)為C6和C7，編輯效率為5.5%。研究發(fā)現(xiàn)，利用“all-in-one”修飾的CBE得到的1個使MSTN基因提前終止的巴馬豬的單克隆細胞系，編輯效率為5.6%[15]，與本試驗結果相近。根據文獻報道，利用YE1-BE3-FNLS編輯HEK 293T細胞，在C5～C7位點的平均編輯效率為78.3%[16]。因此，將堿基編輯器用于編輯哺乳動物體細胞時，應該注意細胞類型對編輯效率的影響。

除此之外，在目標位點附近發(fā)現(xiàn)了脫靶現(xiàn)象，C3位點發(fā)現(xiàn)了G(C)→A(T)突變，編輯效率為16.4%，高于目標位點。推測可能與目標突變位點的序列有關。本研究目標突變位點的序列為5′-C(G)-GG(CC)-T(A)-3′(CC為突變位點)，C之前的堿基為G，而非目標突變位點的序列為5′-A(T)-G(C)-A(T)-3′，且C之前堿基為T，該編輯器使用的脫氨酶是rAPOBEC1，其脫氨酶脫氨效率為TC>CC>GC[5]，這解釋了C3的編輯效率大于目標位點C6和C7的原因。因此，在設計sgRNA時應該注意目標位點附近的堿基序列，減少脫靶現(xiàn)象發(fā)生。研究證明，腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor，ABE)的特異性高于CBE[17]，Jeong等[18]通過改造ABE得到的ABE7.10(P48R)變體，發(fā)現(xiàn)其具有更高的脫氨率和較低的腺嘌呤編輯率，它還可以實現(xiàn)TC→TT或TC→TG的替換，因此，利用ABE引入終止密碼子是降低脫靶率的潛在方法之一。綜上所述，針對CBE堿基編輯器在體細胞中編輯效率較低且在高C位點易脫靶的問題，筆者認為，鑒于ABE比CBE具有更高編輯效率和較低的脫靶率，因此可以利用ABE堿基編輯器人工創(chuàng)造終止密碼子。

4 結 論

本研究利用電轉染的方法將pMLM3636-puro-MSTN和YE1-BE3-FNLS共轉入寧鄉(xiāng)花豬的腎成纖維細胞中，在紅色熒光和嘌呤霉素雙篩選的情況下，獲得了陽性單克隆細胞。結果顯示，在MSTN基因第2外顯子處成功引入終止密碼子，且目標位點G→A的編輯效率為5.5%。與野生型相比，試驗組10號單克隆細胞MSTN蛋白的表達量降低約60%。本研究成功運用了單堿基編輯技術在寧鄉(xiāng)花豬MSTN基因編碼區(qū)實現(xiàn)定點編輯，為后期生產瘦肉率高的堿基突變豬奠定基礎。