山羊干擾素刺激基因15克隆、生物信息學分析及亞細胞定位

唐井玉，杜漢宇，2，孟春春，劉光清

(1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.新疆農業(yè)大學，烏魯木齊 830052)

干擾素刺激基因15 (interferon-stimulated gene 15,ISG15) 是干擾素誘導最強烈最快的ISG分子之一。所有物種的ISG15具有相似的結構，均由2個泛素樣蛋白 (Ubiquitin-like protein,Ubl) 結構域組成并都含有特征性的β-折疊，這2個結構域被稱為“鉸鏈”的多肽序列連接[1]。但與其他泛素蛋白相比，ISG15序列差異大，具有多樣性的特征。ISG15有2種發(fā)揮作用的形式，一種是通過ISG化修飾與蛋白質中的賴氨酸殘基結合發(fā)揮作用，整個過程與泛素化過程相似，包括了E1激活酶、E2結合酶和E3連接酶，USP18解聚酶可以將ISG15從被修飾的蛋白質上移除[2]，目前鑒定出的可以被ISG化修飾的蛋白已有上百種[3]；另一種作用形式是未結合的處于游離狀態(tài)的ISG15。

ISG15具有多種生物學功能，包括調節(jié)宿主對病原微生物感染的應答[4-5]、調節(jié)宿主信號通路[6-7]、發(fā)揮免疫調節(jié)作用[8]，同時還參與調節(jié)宿主損傷和DNA修復[9-10]、腫瘤的發(fā)生[11]、凋亡和自噬[12]，在生命活動過程中發(fā)揮重要的作用。目前關于羊ISG15的研究較少，主要研究集中在ISG15對反芻動物妊娠期的調節(jié)，ISG15被認為是決定子宮對胚胎接受性的重要因素之一。牛、水牛和綿羊在妊娠早期ISG15會短暫表達[13]。羊ISG15在抑制病毒感染、調節(jié)山羊乳腺上皮細胞凋亡和炎癥等方面有了初步研究[14-15]。

ISG15從發(fā)現(xiàn)至今已有40多年，但由于不同宿主物種之間ISG15功能和結構之間存在差異，因此研究進展緩慢。目前關于人和小鼠ISG15的作用、空間結構等研究較多，但對于山羊的研究報道較少。本研究克隆表達山羊ISG15并通過生物信息學分析了解其基本的信息、結構和功能，對其亞細胞定位初步研究，旨在進一步理解山羊ISG15蛋白質的功能，為后續(xù)研究山羊ISG15的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細胞 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；真核表達質粒pCMV-Myc載體、HEK-293T細胞和山羊子宮內膜上皮細胞(EEC)均由上海獸醫(yī)研究所伴侶動物生物安全與防控技術團隊保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 反轉錄試劑、膠回收試劑盒和無縫連接試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Trizol、Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑盒、蛋白Marker、ECL顯色液、羊抗兔熒光二抗594和羊抗鼠熒光二抗594均購自Thermo公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶均購自NEB公司；DMEM-F12、DMEM和Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；鼠源Myc單克隆抗體、牛血清白蛋白均購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司；兔源ISG15多克隆抗體由上海獸醫(yī)研究所伴侶動物生物安全與防控技術團隊制備并保存；藍色熒光染料DAPI購自上海碧云天生物技術有限公司。倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中預測的山羊ISG15基因序列(登錄號：XM_005690795)，利用SnapGene軟件設計擴增山羊ISG5基因的特異性引物，上游引物ISG15-F：5′-tggaggcccgaattcGGATGGGCGGGGACCTGAAG-3′，下游引物ISG15-R：5′-ggccgcggtacctcgagCTACCC-ACCCCGCAGACG-3′，上、下游引物分別加入pCMV-Myc載體中EcoRⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點兩端的同源臂(小寫字母部分)，預期擴增片段大小為474 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 山羊ISG15基因PCR擴增 將EEC細胞樣品按照Trizol說明書提取總RNA。根據(jù)反轉錄試劑盒說明進行反轉錄得到的cDNA。以cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，PCR反應體系50 μL：2×Phanta Max MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 pCMV-Myc-ISG15重組真核表達載體的構建及表達 將pCMV-Myc質粒用EcoRⅠ和XhoⅠ兩個限制性內切酶37 ℃酶切2 h，使其線性化，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物與酶切后的載體進行膠回收，測定濃度。將回收后的酶切產(chǎn)物和線性化的pCMV-Myc載體通過ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (C112) 進行同源重組。插入片段與線性化載體摩爾比為2∶1，同源重組反應體系為：線性化載體1 μL，目的片段3 μL，5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，ExnaseⅡ 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR儀中37 ℃連接30 min，然后將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選菌落，PCR鑒定正確后送至北京擎科生物科技有限公司測序。測序正確后根據(jù)無內毒素質粒小提中量試劑盒說明書提取質粒并測定濃度。將構建完成的pCMV-Myc-ISG15質粒按照Lipofectamine 3000脂質體轉染說明轉染至HEK-293T細胞中，轉染pCMV-Myc空載為對照組。轉染24 h收取細胞樣品進行Western blotting檢測pCMV-Myc-ISG15質粒的表達。

1.2.4 山羊ISG15基因的生物信息學分析 從NCBI-Uniport(https:∥www.uniprot.org)和GenBank兩個數(shù)據(jù)庫中獲得其他19個物種的ISG15序列(表1)，利用MegAlign和Mega 6.0軟件對ISG15基因核苷酸和氨基酸序列相似性比對及系統(tǒng)進化樹進行分析；同時利用在線軟件ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)對山羊ISG15理化性質進行分析；利用TMHMN Server v.2.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0) 和SignalP 5.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)、NetNGlyc-1.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)、YinOYang (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?YinO Yang-1.2)和NetPhos-3.1程序(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預測山羊ISG15蛋白的跨膜結構、信號肽、N-糖基化、O-糖基化位點和磷酸化位點；利用SPOMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 和SWISS-MODEL軟件(https:∥swissmodel.expasy.org)預測山羊ISG15蛋白的二級結構和三級結構；利用STRING軟件(https:∥cn.string-db.org)預測與山羊ISG15相互作用的蛋白；通過PredictProtein (http:∥predictprotein.org) 預測山羊ISG15蛋白的生物學功能；應用在線軟件PSORT Ⅱ Prediction (http:∥psort.hgc.jp/form2.html) 預測山羊ISG15蛋白在細胞中的定位。

1.2.5 山羊ISG15蛋白在EEC細胞中的亞細胞定位 將pCMV-Myc-ISG15質粒轉染至EEC細胞，36 h后進行間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay,IFA)，檢測外源性ISG15的亞細胞定位。同時用小反芻獸疫病毒(PPRV)感染EEC細胞，36 h后進行IFA，檢測內源性ISG15的亞細胞定位。

表1 GenBank中不同物種ISG15基因序列信息

2 結 果

2.1 山羊ISG15基因的克隆、真核表達載體的構建和表達

以EEC細胞cDNA為模板擴增山羊ISG15基因，獲得了474 bp的目的條帶(圖1A)，與預期結果相符?；厥誔CR產(chǎn)物連接至pCMV-Myc酶切后的空載體(圖1B)，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行陽性克隆篩選，并將PCR鑒定正確的pCMV-Myc-ISG15質粒送測序后，對比序列發(fā)現(xiàn)克隆的山羊ISG15與NCBI數(shù)據(jù)庫中預測的序列一致，且pCMV-Myc-ISG15質粒構建成功。將pCMV-Myc-ISG15質粒轉染至HEK-293T細胞，24 h后收取細胞樣品，經(jīng)Western blotting鑒定發(fā)現(xiàn)構建的pCMV-Myc-ISG15質粒成功表達，大小約為17 ku(圖1C)。

A，山羊ISG15基因CDS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物：M1，DL2000 DNA Marker；1，ISG15基因擴增產(chǎn)物；2，陰性對照。B，pCMV-Myc載體EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切圖：M2，DL5000 DNA Marker；1-2，pCMV-Myc空載EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切。C，山羊ISG15真核表達產(chǎn)物：M3，蛋白質分子質量標準；1，pCMV-Myc-ISG15質粒表達產(chǎn)物；2，pCMV-Myc質粒表達產(chǎn)物A，PCR amplification product of ISG15 gene CDS in goats：M1，DL2000 DNA Marker;1，ISG15 gene amplification product;2，Negative control.B，pCMV-Myc plasmid digested by EcoRⅠ和XhoⅠ：M2，DL5000 DNA Marker;1-2，pCMV-Myc empty EcoRⅠ and XhoⅠ double digest.C，Eukaryotic expression product of ISG15 in goats：M3，Protein Marker;1，Expression product of pCMV-Myc-ISG15 plasmid;2，Expression product of pCMV-Myc plasmid圖1 山羊ISG15基因擴增及表達Fig.1 Amplification and expression of ISG15 gene in goats

2.2 相似性比對和系統(tǒng)進化樹構建

2.2.1 相似性比對 核苷酸和氨基酸序列相似性分析結果發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15與盤羊核苷酸和氨基酸序列相似性最高，分別為99.2%和100%，與綿羊的相似性次之，分別為98.9%和99.4%，與小鼠的核苷酸和氨基酸序列相似性最低，分別僅有72.6%和62.8%，與人的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為75.8%和65.2%(表2)。MegAlign分析20個物種ISG15的氨基酸保守性，結果發(fā)現(xiàn)不同物種的ISG15序列長度不同，起始和終止位置也不相同，但末端均含有LRLRGG。與山羊ISG15相比，不同物種在不同位置氨基酸保守性有差異，在山羊ISG15的50-80位氨基酸區(qū)域突變較為集中。從整體上來看不同物種的ISG15序列具有多樣性。

2.2.2 系統(tǒng)進化樹構建 系統(tǒng)進化樹分析結果表明，山羊與綿羊和盤羊屬于一個分支，與奶牛、牦牛和水牛屬于一個大分支；羊駝、單峰駝和雙峰駝屬于一個小分支，人和獼猴屬于一個分支；大鼠和小鼠則屬于另一個分支。從進化樹圖可以看出羊與牛類親緣性較近，與靈長類和嚙齒類親緣性較遠(圖2)。

圖2 ISG15基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ISG15 gene

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15基因位于16號染色體上，CDS全長474 bp，編碼區(qū)從第128位開始，止于601位，編碼157個氨基酸。ProtParam分析發(fā)現(xiàn)，ISG15蛋白分子質量約為17.47 ku，等電點為6.83，分子式為C766H1252N216O299S10，由20種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu,L)有21個，含量最高，占13.4%，色氨酸(Trp,W) 含量最低，僅有1個，占0.6%；其中帶正電荷殘基(Asp+Glu)與帶負電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)目相等，均為17(表3)。失穩(wěn)指數(shù)(instability index,II) 為41.73，由于該值>40，因此該蛋白歸為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族指數(shù)(aliphatic index)為96.75。親水性平均值(grand average of hydropathicity,GRAVY) 為-0.148，該值<0，因此判斷山羊ISG15蛋白為親水性蛋白。

表3 山羊ISG15蛋白氨基酸組成

續(xù)表

2.3.2 跨膜結構及信號肽預測 在線軟件TMHMN Server v.2.0和SignalP 5.0預測結果顯示，山羊ISG15蛋白沒有跨膜結構(圖3A)，也沒有信號肽(圖3B)。

圖3 山羊ISG15蛋白跨膜結構(A)及信號肽(B)預測Fig.3 Prediction of transmembrane structure (A) and signal peptide (B) of ISG15 protein in goats

2.3.3 糖基化和磷酸化位點預測 預測結果顯示，山羊ISG15蛋白存在1個潛在的N-糖基化位點，位于第77位氨基酸處(圖4A)；存在16個潛在的O-糖基化位點，分別位于第22、26、50、69、70、79、81、93、94、95、101、103、125、143、144和147位氨基酸處(圖4B)；存在10個潛在的磷酸化位點，其中包括6個絲氨酸位點(位于第22、69、93、94、95及105位氨基酸處)和4個蘇氨酸位點(分別位于第101、103、144及147位氨基酸處)(圖4C)，結果顯示該蛋白的磷酸化可能與蛋白激酶C (PKC)、肌酸激酶Ⅰ(CKⅠ)、DNA依賴性蛋白激酶 (DNAPK)、蛋白激酶A (PKA)、肌酸激酶Ⅱ(CKⅡ) 等有關。

圖4 山羊ISG15蛋白糖基化(A、B)和磷酸化位點(C)預測Fig.4 Prediction glycosylation (A and B) and phosphorylation (C) sites of ISG15 protein in goats

2.3.4 山羊ISG15蛋白二級結構、三級結構及互作蛋白預測 利用在線軟件SPOMA分析山羊ISG15的二級結構，發(fā)現(xiàn)該蛋白由4種結構組成，分別為無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α-螺旋和β-轉角，所占比例分別為34.39%、31.21%、21.66%和12.74%(圖5)。根據(jù)SWISS-MODEL分析得到的山羊ISG15的三級結構與二級結構相似，也是由α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈構成(圖6)。與參考的綿羊ISG15模板相似性較高，達到了98.72%。利用STRING預測與山羊ISG15蛋白相互作用的蛋白，結果發(fā)現(xiàn)預測中的蛋白主要為干擾素和泛素化相關的蛋白。其中已經(jīng)試驗證明與其相互作用的蛋白有泛素激活酶 (Ubiquitin-activating enzyme,UBA7)、USP18和DDX解旋酶58 (DEDA-box RNA helicase,DDX58)。預測ISG15還與抗黏液病毒1 (Myxovirus resistance protein 1,MX1)、抗黏液病毒2(Myxovirus resistance protein 2,MX2)、寡腺苷酸合成酶1 (2′,5′-oligoadenylate synthetase 1,OAS1)、干擾素調節(jié)因子7 (interferon regulatory factor 7,IRF7)、干擾素誘導蛋白6 (interferon-inducible protein 6,IFI6)、干擾素誘導蛋白44 (interferon-inducible protein 44,IFI44)相互作用 (圖7)。

h，α-螺旋；e，延伸鏈；c，無規(guī)則卷曲；t，β-轉角h，Alpha helix;e，Extended chain;c，Random coil;t，Beta turn圖5 山羊ISG15蛋白二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of ISG15 protein in goats

圖6 山羊ISG15蛋白三級結構預測Fig.6 Tertiary structure prediction of ISG15 protein in goats

圖7 山羊ISG15互作蛋白預測Fig.7 Prediction of proteins interacting with ISG15 in goats

2.3.5 蛋白功能預測 通過PredictProtein在線軟件預測和分析山羊ISG15蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)ISG15可能對細菌和病毒具有防御作用，通過負向調節(jié)病毒基因組的復制來達到防御病毒的目的；負向調節(jié)蛋白質泛素化；正向調節(jié)紅細胞分化和造血過程；調節(jié)Ⅰ型干擾素和γ干擾素；調控白細胞介素10的產(chǎn)生；參與調節(jié)多種信號通路。

2.3.6 亞細胞定位預測 通過在線軟件Psort Ⅱ Prediction對山羊ISG15蛋白亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15主要定位在細胞質中，在細胞質中發(fā)揮作用，可能性約占69.6%。同時山羊ISG15還可能分布在細胞核、線粒體和分泌系統(tǒng)的囊泡中，并在其中發(fā)揮作用。

2.4 IFA檢測山羊ISG15蛋白在EEC細胞中的定位

通過IFA試驗發(fā)現(xiàn)，轉染ISG15后，該蛋白主要在細胞質中表達(圖8A)。未用外源刺激物刺激，EEC細胞中無法檢測到ISG15，用外源刺激物(PPRV)感染后，EEC細胞中可以檢測到ISG15蛋白，并且也主要定位在細胞質中(圖8B)。結果證實內源性與外源性ISG15均定位于細胞質中，此結果與軟件預測結果一致。

A，外源性ISG15蛋白在EEC細胞中的定位；B，內源性ISG15蛋白在EEC細胞中的定位A，Localization of exogenous ISG15 protein in EEC cells;B，Localization of endogenous ISG15 protein in EEC cells圖8 山羊ISG15蛋白在EEC細胞中的定位(200×)Fig.8 Localization of ISG15 protein in EEC cells in goats (200×)

3 討 論

ISG15是宿主對微生物感染反應的關鍵成分，本研究克隆了山羊ISG15的CDS區(qū)序列，通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)山羊和人該序列的相似性僅為65.2%，與盤羊相似性最高。以往的研究表明，某些哺乳動物和魚類之間，相似性僅為30%～35%，即使兩個不同的哺乳動物之間序列相似性也可能小于60%[16]。ISG15氨基酸的保守性分析發(fā)現(xiàn)，不同物種間ISG15長度不同，但在C-末端均含有LRLRGG序列，這對于翻譯后修飾蛋白質至關重要。氨基酸序列差異性大，在山羊ISG15的50-80位氨基酸區(qū)域表現(xiàn)出明顯的序列變異。序列的差異性導致相似性高的物種之間ISG15的性質也存在差異。魯海富等[17]報道的新疆野生盤羊ISG15為疏水性蛋白，且有一個跨膜區(qū)，本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15為親水性蛋白且沒有跨膜結構。崔茹鵬等[18]報道的巴什拜羊ISG15基因編碼區(qū)全長為522 bp，比本研究克隆的山羊ISG15基因長了48 bp。蔡卓軒等[19]報道牛的ISG15基因編碼區(qū)為465 bp，比山羊的少了9 bp。序列的差異性會導致不同物種間ISG15的二級結構存在差異。山羊ISG15二級結構中無規(guī)則卷曲所占比例最多，約34.39%，β-轉角僅占12.74%，而在新疆野生盤羊中存在10個β-轉角[18]，在牛中β-轉角僅占17.53%[19]。

越來越多的證據(jù)表明，ISG15序列多樣性會影響其三級結構，主要是保守的殘基在結構域之間形成疏水界面，從而可能形成一系列的構象。人和小鼠的ISG15蛋白的三級結構整體構象存在著巨大的差異，在人ISG15中Asp79的羧基與Thr101的羥基形成氫鍵，在ISG15的鉸鏈區(qū)形成一個扭結，但在小鼠ISG15中由于Ser77代替了Asp79，因此沒有此現(xiàn)象[20]。與綿羊ISG15相比，牛ISG15的鉸鏈區(qū)內缺乏3個殘基導致牛ISG15在溶液中的穩(wěn)定性較低，這可能與2個Ubl結構域的空間排列不同所致，后面研究證明牛ISG15兩個Ubl結構域的扭曲方向完全不同[21]。因此解析綿羊ISG15的結構對于驗證這些鉸鏈區(qū)殘基對三級結構的作用有著重要價值。

ISG15序列的多樣性可以影響其生物學功能。與犬、小鼠和牛等其他物種的ISG15相比，乙型流感的NS1蛋白能夠更有效地結合人和非人靈長類動物ISG15，這一發(fā)現(xiàn)表明，這可能是決定宿主易感性的主要因素[21]。這種現(xiàn)象同樣在內羅病毒和冠狀病毒中存在。內羅病毒的卵巢腫瘤家族蛋白(ovarian tumor family,OTU) 在體外與不同物種的ISG15相互作用不同[22]。冠狀病毒的木瓜酶樣蛋白酶(papain-like proteases,PLP) 與不同物種ISG15相互作用的能力上也有很大的差異，與人ISG15相比，小鼠ISG15的結合方向偏移了27°，蛋白酶結構也發(fā)生了相應的變化以適應它。重要的是，它還反映了不同冠狀病毒之間已知宿主范圍的差異[20]。ISG15對人和小鼠的USP18影響不同，與小鼠ISG15相比，人ISG15與USP18結合更強。研究者認為人和小鼠之間ISG15和USP18的序列差異是這種功能差異的根源[23]。蛋白亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15主要定位于細胞質中(69.6%)，通過外源性轉染ISG15真核表達質粒和PPRV感染刺激內源性ISG15的表達，發(fā)現(xiàn)ISG15定位于細胞質中，與預測結果相一致。同時本研究發(fā)現(xiàn)，未感染PPRV的EEC細胞中，通過IFA無法檢測到ISG15的表達，表明PPRV感染可以刺激ISG15的表達。很多研究發(fā)現(xiàn)ISG15能夠被病毒刺激上調表達，并發(fā)揮著其抗病毒作用[4,24]。該結果為后續(xù)研究ISG15在PPRV感染中的作用提供了基礎。

ISG15是介導和調節(jié)宿主對病毒感染反應的重要組成部分。由于作用機理的差異，在不同病原體之間甚至在不同宿主物種之間的重要性有所不同。ISG15的序列和結構多樣性增加了探索其在不同物種間作用的難度。不同物種間ISG15的生物信息學分析為后續(xù)的研究奠定了基礎。

4 結 論

本研究成功克隆了山羊ISG15基因CDS區(qū)，全長474 bp，編碼157個氨基酸。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)山羊與盤羊ISG15序列相似性最高；山羊ISG15蛋白沒有跨膜結構和信號肽區(qū)域，含有1個N-糖基化位點、16個O-糖基化位點和10個磷酸化位點；二級結構主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈構成；山羊ISG15蛋白可以與干擾素和泛素化相關蛋白相互作用；亞細胞定位發(fā)現(xiàn)內源性和外源性ISG15均定位于EEC細胞的細胞質中。