視黃酸受體α通過調控視皮質軸突蛋白1參與維生素A缺乏大鼠孤獨癥樣行為的機制研究

李莉莎 張倩 劉歡 吳瓊輝 楊亭 陳潔 李廷玉

（重慶醫科大學附屬兒童醫院兒童保健科/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒童營養與健康重慶市重點實驗室，重慶 400014）

維生素A（vitamin A，VA）是維持機體生長發育及穩態平衡的重要脂溶性維生素，維生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）迄今仍是發展中國家重要的公共衛生問題［1］。孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是以社交缺陷和重復刻板為主要核心癥狀的一種異質性神經發育障礙［2］。孕期VAD可致腦發育異常且與ASD的發生發展有關，其中VA水平和ASD核心癥狀具有相關性［3］，維生素A補充（vitamin A supplement，VAS）可在一定程度上緩解VAD的ASD兒童的核心癥狀［4］。視黃酸（retinoic acid，RA）是VA在體內發揮作用的主要活性形式，RA可通過與視黃酸受體（retinoic acid receptors，RARs）結合調控靶基因轉錄活性［3］。本課題組的既往研究表明，孕期開始的持續VAD或其他環境因素可通過下調子代大鼠體內RA信號通路誘導其產生孤獨癥樣行為［5-7］，但RA信號通路異常誘導孤獨癥樣行為的具體機制有待進一步探討。

ASD病因復雜，目前研究表明其風險基因多匯集在突觸功能相關的通路上。軸突蛋白1（neurexin 1，NRXN1）基因是其中一個突觸相關的ASD風險基因，其編碼的突觸蛋白在突觸傳遞和可塑性中起核心作用［8］。NRXN1蛋白由NRXN1α亞型和NRXN1β亞型組成，NRXN1蛋白水平的變化可能影響突觸可塑性從而導致ASD等神經精神障礙［8-9］，但NRXN1參與ASD的具體發病機制及其上游調控因子并不清楚。目前認為ASD發病是因為全腦神經網絡故障［10］，磁共振光譜檢測發現ASD兒童視皮質的功能連接存在異常，且伴隨突觸穩態可塑性失衡，這些異常與ASD核心癥狀的嚴重程度相關［11-13］，提示視皮質也可能參與到ASD的發生和發展。本課題組前期發現孕期VAD可通過下調仔鼠前額葉、丘腦、小腦等多個腦區的RA信號，從而誘導出仔鼠孤獨癥樣行為，進一步研究發現RA信號通路調控ASD相關風險基因（RORA、CD38、OXT等）［5，14］是其潛在機制。但RA信號通路是否影響視皮質，進而參與大鼠ASD樣行為的研究未見報道。NRXN1是視皮質可塑性中重要的分子基礎［15-16］，研究發現視黃酸受體α（retinoic acid receptorα，RARα）與視皮質突觸可塑性有關［17］，并且大腦中RA與NRXN1的表達相關［18］。為此，本文建立了不同VA水平的孕鼠模型，通過子代缺乏和早期補充，探討RARα信號變化對VAD大鼠視皮質NRXN1的影響及其與孤獨癥樣行為的關聯。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型構建

9只SPF級Sprague-Dawley母鼠按照1∶2的比例隨機分為維生素A正常（vitamin A normal，VAN）飲食（VA含量6 500 IU/kg）和VAD飲食（VA含量400 IU/kg）。喂養4周后，待各組母鼠血清VA水平達到標準（VAN母鼠≥1.05μmol/L；VAD母鼠<1.05μmol/L）［14］進行雌雄合籠（1∶1）。將VAN母鼠納入VAN組，VAD母鼠隨機分為VAD組和VAS組，每組3只。從母鼠孕期和哺乳期，到仔鼠生后6周齡，VAN組母鼠和仔鼠均喂養VAN飼料；VAD組母鼠和仔鼠均喂養VAD飼料。VAS組母鼠孕期喂養VAD飼料，哺乳期喂養VAN飼料；仔鼠從生后第1~7天通過灌胃補充VA（溶于大豆油，83.33 IU/d，每天1次），仔鼠斷奶后到6周齡喂養VAN飼料。VAN組和VAD組仔鼠在生后第1天均給予同等劑量大豆油（不含VA）灌胃，連續7 d。各組仔鼠在6周齡時隨機抽取20只雄鼠進行ASD相關行為學測試，測試完成后收集血清和腦組織，進行相關生化和電生理檢測。由于雌鼠生長緩慢不易達到VAD表型［5］，本研究中所用仔鼠均為雄性。本實驗經重慶醫科大學附屬兒童醫院動物實驗倫理委員會批準（CHCMUIACUC20200424017）。

1.2 行為學檢測

使用ANY-Maze視頻跟蹤系統（美國Stoelting公司）測試仔鼠的孤獨癥樣行為。在曠場實驗中，曠場箱被分為中央區和周邊區，依次將各組仔鼠從中央區放入，測試時間5 min。攝像系統記錄每只仔鼠在中央區的時間以評估其探索行為，記錄自我理毛時間明確是否具有重復刻板行為表現［19］。

三箱實驗在連通的透明三室箱中進行，是評估大鼠社交能力的經典方法［19］。第1天，在中間箱放入仔鼠并讓其適應5 min。第2天，在兩側箱的金屬籠中各放入1只同齡、同性別的陌生鼠和1個玩具，受測鼠從中間箱放入后在裝置中自由探索5 min。第3天，在兩側箱的金屬籠中分別放入陌生鼠和與受測鼠同籠同性別的熟悉鼠，受測鼠再次從中間箱放入后自由探索5 min。攝像系統記錄受測鼠在每個箱內的活動時間，觀察大鼠的社交能力。

1.3 樣本收集和血清視黃醇測定

各組仔鼠麻醉后股動脈采血，離心取血清。開顱取出大鼠腦枕葉的視皮質組織。取血清200μL，以甲醇∶水為97∶3（100μL）為流動相，采用高效液相色譜法（DUG-HPLC-20AT，日本）測定血清視黃醇水平［7］。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測mRNA水平

采用Promega Biotech總RNA提取試劑盒（Promega，美國）提取大鼠視皮質組織RNA。用Prime Script RT試劑盒（Takara，日本）制備cDNA。引物序列如下：RARα：上游5'-ATTGCCGACCAGATTACC-3'， 下 游 5'-AAAGCCAGCGTTGTGC-3'；N-甲基-D-天冬氨酸受體 1（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1，NMDAR1）：上游5'-AAGCTGCACGCCTTTATCTG-3'，下 游5'-TTCTCATGGGACTTGAGTATGGA-3'；NRXN1：上游5'-GCGTCAGCACTCAGGCATTGG-3'，下 游 5'-TTCTTGCGTGTAGCCCGTTGTG-3'；GAPDH：上 游5'-CCTGGAGAAACCTGCCAAG-3'，下游5'-CACAGGAGACAACCTGGTCC-3'。cDNA在聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-Rad，美國）上進行擴增，反應體系及反應條件參考PCR SYBR green試劑盒（QIAGEN，德國）說明書。各目的基因以GAPDH為內參照，結果采用2-ΔCt公式計算得出。

1.5 Western blot法檢測蛋白水平

提取大鼠視皮質組織總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒（ATGene，美國）檢測蛋白濃度。通過電泳、轉膜、封閉，分別加入相應的一抗：兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗體（1∶1 000，Abcam，英國）、兔抗大鼠NRXN1α多克隆抗體（1∶10 000，Merck，德國）、兔抗大鼠NRXN1β多克隆抗體（1∶2 000，蘇州百遠生物科技有限公司），兔抗大鼠RARα多克隆抗體（1∶1 000，Genetex，美國），小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體（1∶5 000，Proteintech，美國）。在4℃冰箱孵育過夜，PBST漂洗3次后加入相應二抗：HRP標記山羊抗兔多克隆抗體（1∶5 000，ATGene，美國）、HRP標記山羊抗小鼠多克隆抗體（1∶5 000，ATGene，美國），室溫孵育1 h，漂洗后ECL發光顯影。使用Image J軟件計算條帶灰度值，全蛋白以GAPDH為內參。結果以目的蛋白與內參GAPDH蛋白比值表示。

1.6 染色質免疫共沉淀檢測

采用染色質免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）試 劑 盒（Millipore，Bedford，美國）進行ChIP檢測。將視皮質組織勻漿、交聯、超聲打斷DNA、用抗RARα抗體（sc-293417，Santacruz，美國）和IgG抗體（陰性對照）孵育制備protein G/antibody/protein/DNA復合物，樣品解交聯后進行DNA純化，利用LASAGNA-SEARCH 2.0轉錄因子數據庫設計NRXN1基因啟動子區域引物序列，行PCR檢測。NRXN1基因啟動子的引物序列如下：上游5'-AACTGTCTTCAGCTGCCATC-3'， 下 游 5'-TCTTGGGCTGTGCATGTATG-3'；用2-ΔΔCt計算相對于IgG的富集倍數，其中ΔΔCt=（標準化CtIPCtIgG）。

1.7 電生理記錄

各組仔鼠麻醉后，4℃切片液灌注心臟。取出完整腦組織，并轉移到4℃含氧人工腦脊液中。用振動切片機將視皮質組織行冠狀位切片后孵育1 h。刺激電極刺激視皮質的Ⅳ層，記錄電極放置于視皮質的Ⅱ~Ⅲ層，記錄場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）。刺激強度為最大電場電位的50%，記錄fEPSP 15 min（基線）。用高頻電刺激（high frequency train stimulation，HFS）誘導長時程增強（long-term potentiation，LTP）并記錄45 min。HFS誘發后的fEPSP振幅較基線超過20%且持續至少30 min，稱為成功誘導LTP。使用PClamp10軟件（Molecular Devices）進行數據收集、分析和處理。

1.8 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同VA水平大鼠血清視黃醇水平

視黃醇是臨床評估VA缺乏的診斷指標。3組（分別n=20）仔鼠血清視黃醇水平比較差異有統計學意義（F=232.87，P<0.001）。VAD組仔鼠血清視黃醇水平［（0.53±0.06）μmol/L］明顯低于VAN組［（1.21±0.13）μmol/L］和VAS組［（1.14±0.12）μmol/L］（P<0.05）；VAS組血清視黃醇水平恢復至正常，與VAN組比較差異無統計學意義（P>0.05）。這一結果表明，我們成功構建了VAN、VAD和VAS大鼠模型。

2.2 不同VA水平大鼠行為學檢測結果

在曠場實驗中，各組大鼠的移動總行程差異無統計學意義（P>0.05），表明孕期較低的視黃醇水平未損害后代視力相關的運動活動。與VAN組相比，VAD組在中央區停留時間更少（P<0.05），自我理毛時間更長（P<0.05）。與VAD組相比，VAS組在中央區停留時間更長（P<0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠曠場實驗移動軌跡圖

表1 各組大鼠曠場實驗結果比較 （±s，n=20）

表1 各組大鼠曠場實驗結果比較 （±s，n=20）

注：［VAN］維生素A正常；［VAD］維生素A缺乏；［VAS］維生素A補充。a示與VAN組比較，P<0.05；b示與VAD組比較，P<0.05。

組別VAN組VAD組VAS組F值P值移動總行程(m)10.1±2.2 9.4±2.3 9.7±1.9 0.472 0.626中央區停留時間(s)4.5±2.6 1.6±1.5a 3.9±3.4b 6.820 0.002自我理毛時間(s)30±9 43±13a 35±7 9.216<0.001

在三箱實驗對陌生鼠與玩具間的社交偏好測試中，結果顯示VAD組在陌生鼠箱中的停留時間顯著短于VAN組和VAS組（P<0.05），在玩具箱中的停留時間則顯著長于VAN組和VAS組（P<0.05）。在對陌生鼠與熟悉鼠的社交偏好測試中，結果顯示VAD組在陌生鼠箱中的停留時間顯著短于VAN組和VAS組（P<0.05），在熟悉鼠箱中的停留時間顯著長于VAN組和VAS組（P<0.05）。提示妊娠期VAD會損害后代的社會互動和社會新奇認知水平；生后早期補充VA后，這些受損行為可得到改善。見圖2、表2。

表2 各組大鼠三箱實驗各箱停留時間比較 （±s，s，n=20）

表2 各組大鼠三箱實驗各箱停留時間比較 （±s，s，n=20）

注：［VAN］維生素A正常；［VAD］維生素A缺乏；［VAS］維生素A補充。a示與VAN組比較，P<0.05；b示與VAD組比較，P<0.05。

組別VAN組VAD組VAS組F值P值陌生鼠與玩具的社交偏好測試玩具箱110±31 143±24a 112±29b 8.476 0.001中間箱49±17 45±13 49±23 0.334 0.718陌生鼠箱141±28 112±22a 138±30b 6.746 0.002陌生鼠與熟悉鼠的社交偏好測試熟悉鼠箱116±38 170±54a 124±49b 7.511 0.001中間箱43±22 38±32 36±25 0.353 0.704陌生鼠箱141±35 92±42a 140±41b 10.146<0.001

圖2 各組大鼠三箱實驗移動軌跡圖 上圖為大鼠在陌生鼠箱與玩具箱中移動的軌跡圖；下圖為大鼠在陌生鼠箱與熟悉鼠箱中移動的軌跡圖。

2.3 不同VA水平大鼠視皮質突觸可塑性的變化

為研究孕期VAD對后代視皮質可塑性的影響，檢測突觸可塑性關鍵蛋白NMDAR1的表達水平和LTP水平［20］。VAD組大鼠視皮質NMDAR1 mRNA和蛋白表達水平均顯著低于VAN組和VAS組（P<0.05）。電生理實驗結果顯示，VAD組大鼠的LTP顯著低于VAN組和VAS組（P<0.05）。提示孕期VAD可能會影響仔鼠視皮質突觸可塑性的改變，生后早期的VA補充能基本挽救VAD所致異常。見圖3、表3。

表3 各組大鼠視皮質NMDAR1相對表達量及LTP水平比較 （±s）

表3 各組大鼠視皮質NMDAR1相對表達量及LTP水平比較 （±s）

注：［NMDAR1］N-甲基-D-天冬氨酸受體1；［HFS］高頻刺激；［LTP］長時程增強。a示與VAN組比較，P<0.05；b示與VAD組比較，P<0.05。

組別VAN組VAD組VAS組F值P值NMDAR1 mRNA相對表達量(n=5)1.00±0.15 0.72±0.90a 0.97±0.08b 8.671 0.005 NMDAR1蛋白相對表達量(n=3)1.00±0.04 0.66±0.05a 0.94±0.03b 45.411<0.001 HFS誘導41~45 min的LTP平均值(n=9)166±14 123±7a 170±14b 85.576<0.001

圖3 VAN組、VAD組和VAS組大鼠視皮質突觸可塑性的改變 左圖為突觸可塑性關鍵蛋白NMDAR1的電泳條帶圖（n=3）。右圖為LTP誘發前后的變化（n=9），用HFS誘發LTP并記錄，其中HFS誘發后的標準化fEPSP斜率增加20%以上且持續至少30 min，提示LTP誘發成功。

2.4 不同VA水平大鼠視皮質RARα和NRXN1表達變化

VAD組大鼠視皮質RARα和NRXN1的mRNA表達水平顯著低于VAN組和VAS組（P<0.05）。VAD組RARα、NRXN1α和NRXN1β的蛋白表達水平顯著低于VAN組和VAS組（P<0.05）。ChIP檢測表明RARα在視皮質NRXN1基因的啟動子上富集。在VAD組中，RARα轉錄因子在NRXN1基因啟動子區域預測位點的富集與VAN組和VAS組相比顯著降低（P<0.05），提示RARα轉錄因子可能通過與NRXN1基因的啟動子結合來調控其轉錄活性。見圖4、表4。

圖4 Western blot法檢測各組大鼠視皮質RARα、NRXN1α、NRXN1β蛋白表達電泳圖（n=3）

表4 各組大鼠組大鼠RARα和NRXN1相對表達量比較 （±s）

表4 各組大鼠組大鼠RARα和NRXN1相對表達量比較 （±s）

注：［VAN］維生素A正常；［VAD］維生素A缺乏；［VAS］維生素A補充。a示與VAN組比較，P<0.05；b示與VAD組比較，P<0.05。［RARα］視黃酸受體α；［NRXN1］軸突蛋白1；［NRXN1α］軸突蛋白1α；［NRXN1β］軸突蛋白1β。

組別VAN組VAD組VAS組F值P值RARαmRNA(n=5)1.00±0.13 0.57±0.64a 0.99±0.17b 16.851<0.001 RARα蛋白(n=3)1.00±0.10 0.52±0.02a 0.94±0.03b 17.667 0.003 NRXN1 mRNA(n=5)1.00±0.11 0.40±0.10a 0.85±0.19b 23.881<0.001 NRXN1α蛋白(n=3)1.00±0.08 0.59±0.03a 0.92±0.12b 17.126 0.003 NRXN1β蛋白(n=3)1.00±0.07 0.51±0.06a 1.01±0.09b 39.221<0.001 RARα在NRXN1基因啟動子區域的富集量水平(n=3)8 280 655±1 015 390 5 136 636±900 535a 80 430 975±612 772b 12.439 0.007

3 討論

ASD兒童常共患嚴重挑食及胃腸道問題，因此易出現營養缺乏癥［21］。研究發現，在ASD兒童常見的微量營養素中，VAD的檢出率（77.9%）最高［22］，且與ASD部分核心癥狀有關。動物實驗發現，生命早期VAD誘導的RA信號下調可能是ASD的風險因素［5］。此外，丙戊酸、三氯生等環境因素均可通過下調RA信號通路參與大鼠孤獨癥樣行為的發生［6，19］。但RA信號對ASD的具體機制還需進一步探討。本研究成功構建了孕期開始的持續VAD大鼠模型，對部分VAD仔鼠生后早期補充VA，其血清VA恢復到正常水平。行為學結果顯示，盡管VAD仔鼠沒有運動活動障礙，但它們表現出明顯的社交障礙和增加的重復性行為，VA補充能有效改善仔鼠的孤獨癥樣行為，這與既往研究［5］結果相同。以上提示孕期VAD可誘發后代的孤獨癥樣行為，孕期VAD可能是ASD的危險因素。

突觸相關基因NRXN1是ASD的易感基因［8］，且參與NMDA介導的突觸傳遞［23］，調節視皮質的突觸可塑性［10，15-16］。Kim等［24］發現ASD患者大腦中NRXN1的表達顯著降低。且NRXN1基因敲除小鼠存在社會交往和認知功能受損的表現［25］。近期研究表明，NRXN1通過影響突觸可塑性穩態參與ASD發病［8-9］。本研究中，VAD組仔鼠視皮質NRXN1的mRNA和蛋白表達水平下降，同時NMDAR1的mRNA和蛋白表達水平下調，LTP降低。生后早期VA補充治療后，VAS組仔鼠的孤獨癥樣行為得到改善，視皮質NRXN1、NMDAR1表達水平和LTP水平明顯改善，提示RA通路異常可通過下調NRXN1表達引起視皮質突觸可塑性異常參與大鼠孤獨癥樣行為的形成。

VA的絕大部分作用是通過RA與RARs的結合進而調控RA靶基因的轉錄表達［3］。RARα信號影響小鼠視皮質的突觸穩態可塑性，該信號受損可能與神經精神疾病有關［17］。有研究報道，NRXN與RA信號通路有關，NRXN的突觸組織者小腦蛋白2直接由RA介導［18］，提示NRXN1可能與RA信號下調引起的后代孤獨癥樣行為的發病機制有關。本研究發現，與VAN組相比，VAD組仔鼠視皮質RARα和NRXN1的表達水平均降低。ChIP檢測結果顯示，VAD組較VAN組在NRXN1基因啟動子區RARα的富集減少，提示RARα信號可能調控NRXN1的轉錄。在VAS組中，VA補充可增加RARα和NRXN1的表達，上調RARα與NRXN1基因啟動子的結合。以上結果表明，妊娠期VAD導致RARα表達減少，從而導致RARα與NRXN1的結合減少，進而影響視皮質的突觸可塑性。近期研究認為，ASD兒童存在全腦神經網絡受損，其神經環路的突觸功能異常與ASD密切相關［10］。從RARα-NRXN1下調引起視皮質可塑性與孤獨癥行為變化的相關性使我們推測這種變化可能參與ASD的神經環路受損，也可能參與VAD仔鼠的孤獨癥樣行為形成。然而本實驗未能有條件檢測視皮質的行為學指標，且僅在體內利用ChIP檢測了RARα可以與NRXN1有結合，尚未在NRXN1基因啟動子上尋找具體的結合位點，這將成為我們下一步的研究重點。

綜上所述，RARα可結合在NRXN1基因啟動子上調控其mRNA表達水平，進而影響大鼠視皮質突觸可塑性參與VAD大鼠孤獨癥樣行為的形成。