Box-Behnken優化超聲波法提取絞股藍總皂苷工藝

杜洪，劉霞，翁濤，潘禮杰，劉月，陳婕，趙琳靜

（上海工程技術大學化學化工學院，上海 201620）

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)Makino）是葫蘆科絞股藍屬草質攀援植物[1]。現代藥理研究表明，絞股藍主要藥效成分皂苷具有良好的抗腫瘤、保護心腦血管、降血脂、保肝、抗氧化和抗胃潰瘍活性[2-4]。超聲法是絞股藍皂苷的常用提取方法之一，相比傳統的溶劑提取法，具有提取時間短、提取溫度低和效率高等優點[5]。本研究利用Box-Behnken設計法對絞股藍皂苷的提取工藝進行優化，并應用優化條件對國內8種產地絞股藍中總皂苷含量進行分析。以期為我國絞股藍資源的開發利用提供參考[6]。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

UN-7504紫外分光光度計，JYD-1200L型超聲波細胞破碎機，YP601N 型精密電子天平，HH-2電熱恒溫水浴鍋。

絞股藍（葉）購自上海某中藥公司，產地分別為陜西平利、湖北恩施、湖南張家界、四川平武、廣東韶關丹霞山、廣西金秀大瑤山、湖北神農架和河南堯山。人參皂苷Rb3標準品購自某生物制品鑒定所。其它試劑為分析純。

1.2 Box-Behnken實驗設計

根據Box-Behnken 實驗設計原理，以提取時間、超聲功率、液料體積質量比3個影響因素為自變量X（每個因素包含3 個水平），以提取液中總皂苷的質量分數w為響應量，設計3 因素3 水平響應面優化實驗，共17個實驗點，具體如表1所示。

1.3 絞股藍總皂苷提取

取粉碎后絞股藍樣品2 g，加入不同體積的無水甲醇，置超聲波細胞破碎儀在不同功率下常溫超聲一定時間，抽濾，得提取液。

1.4 分析方法

標準曲線。配制質量濃度為1 g/L 的人參皂苷Rb3標準品溶液，取不同體積的標準品溶液置10 mL 具塞試管中，揮去溶劑，加入質量分數5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分搖勻，60 ℃反應15 min，冷卻至室溫，加冰醋酸5 mL，混勻，波長550 nm 測光密度。得到線性方程為Y/(mg·g-1)=21.17D(550 nm)-0.025，相關系數R2=0.998。

總皂苷含量測定。參考香草醛-高氯酸比色法[7]。取絞股藍提取液1 mL 加至10 mL 具塞試管中，測定光密度，按照標準曲線并計算不同提取條件下樣液中總皂苷含量。

8 種產地絞股藍皂苷的含量測定。取8 種產地絞股藍，粉碎后采用優化工藝條件超聲提取總皂苷，測定總皂苷含量。每個樣本平行3次，取平均。

1.5 數據統計和分析

使用Design-Expert 7.1.6 軟件對獲得數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 回歸模型及顯著性檢驗

Box-Behnken 響應面實驗及結果見表2，其回歸與方差分析見表3。

表2 Box-Behnken響應面實驗結果Tab 2 Box-Behnken response surface experiment results

表3 回歸與方差分析結果Tab 3 Regression and variance analysis results

使用Design Expert軟件對表2實驗結果進行多元回歸擬合，計算各項回歸系數，得到絞股藍總皂苷質量分數（Y）與3個因子的數學回歸模型為：

如表3 所示，模型項顯著性檢驗結果極顯著（P=0.000 7），表明該模型可用于絞股藍總皂苷提取工藝的預測分析。失擬項較小（F=2.31，P＞0.05），表明實驗誤差小。模型1次項、2次項和交互項顯著性檢驗結果表明，在選擇的各實驗條件范圍內，提取時間和液料體積質量比對絞股藍總皂苷含量的影響極顯著（P＜0.001），超聲功率對絞股藍總皂苷得率無顯著影響。此外，模型交互項X1X3差異顯著（P＜0.05），表明提取時間和液料體積質量比對絞股藍總皂苷得率有交互影響。

響應面和等高線圖直觀顯示了提取時間和液料體積質量比對絞股藍總皂苷含量的交互影響，如圖1所示。

圖1 提取時間和液料體積質量比影響含量的交互作用Fig 1 The interaction of extraction time and solid-liquid volume-to-mass ratio on the yield of gypenosides

由圖1可知，響應曲面的相對坡度陡峭，表明提取時間和提取功率之間的交互作用對絞股藍總皂苷含量影響顯著。當提取時間為15 min，液料質量體積比為60 mL/g時，總皂苷含量達到區間內最大。由等高線可知，提取時間對絞股藍總皂苷含量的影響相比料液比更大。

2.2 優化工藝條件分析及驗證

通過剔除無顯著差異項的優化模型對實驗結果進行預測分析，結果如圖2所示。

圖2 實驗與理論結果對比Fig 2 Analysis of experimental and theoretical results

由圖2 可知，R2=0.953 8，表明預測結果與實驗測定結果擬合情況良好。

Design Expert軟件優化得到的優化提取工藝條件為：提取時間15 min、提取功率360 W、液料體積質量比60 mL/g，在此條件下絞股藍總皂苷的質量分數理論量為25.1 mg/g。為驗證響應面優化結果的可靠性，采用上述優化工藝條件對絞股藍進行超聲提取，并測定提取液中總皂苷含量，平行實驗3次，計算得平均質量分數為24.7 mg/g，與預測量的相對偏差為1.5%。該結果表明通過響應面法優化的絞股藍總皂苷超聲法提取工藝參數準確可靠，具有應用價值。

2.3 8種絞股藍中總皂苷含量分析

對所購8 種產地絞股藍中總皂苷含量進行測定，結果如表4所示。

由表4可知，廣東韶關丹霞山絞股藍中總皂苷含量略最高。

表4 8種產地絞股藍中總皂苷含量分析結果（n=3）Tab 4 Analysis results of total saponins in Gynostemma pentaphyllum from eight habitats(n=3)

3 結 論

通過響應面實驗設計法對超聲波法提取絞股藍總皂苷的工藝條件進行了優化。采用二次回歸分析，建立了提取時間、超聲功率、液料體積質量比3個因子與總皂苷含量的數學回歸模型，得到優化工藝條件為：提取時間15 min，提取功率360 W，液料體積質量比60∶1 mL/g。

經實驗驗證，該模型能較好地預測絞股藍總皂苷得率，可為絞股藍總皂苷提取工藝優化提供科學參考。此外，在納入分析的8個產地絞股藍樣本中，廣東韶關丹霞山樣本中的總皂苷含量最高（質量分數1.361%）。